Закономерности распространения сапонинов и экдистероидов в растениях: хемотаксономический и молекулярно-филогенетический подходы

проекта INTAS с участием нашей лаборатории была сделана попытка построения молекулярно-филоге-нетического древа сем. Caryophyllaceae [1]. Более обширные исследования на основе хемотаксономического и молекулярно-филогенетического подходов в изучении распределения алкалоидов и непротеиногенных аминокислот на примере сем. Fabaceae были проведены Винком [2].

Настоящая работа направлена на выявление связей между распространением двух биогенетически близких групп вторичных метаболитов, связанных общим мевалонатным путем биосинтеза – сапонинов (на примере сем. Fa-baceae ) и экдистероидов (на примере трибы Car-dueae, сем. Asteraceae ) и филогенетической классификацией растений, что позволит оценить их значимость в качестве хемотаксономических маркеров.

Для определения изучаемых нами вторичных метаболитов растений использованы известные экспрессные физико-химические и биологические методы тестирования растений (сапонины): способность к пенообразованию, гемолизу эритроцитов, а также ТСХ- и ВЭЖХ-хроматография. Для установления тонкой структуры соединений использовали методы масс-спектрометрии и ЯМР-спект-роскопии. Для выявления закономерностей распространения сапонинов и экдистероидов реконструирована молекулярная филогения сем. Fabaceae и трибы Cardueae, сем. Asteraceae. При проведении анализа близкородственных таксонов использовали последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 из базы данных GenBank. Последовательности генов выравнивались вручную и с помощью программы ClustalW, входящей в пакет программ MEGA 4. Нами использованы два метода: метод максимальной парсимонии и метод объединения ближайших соседей. Генетические расстояния рассчитывались исходя из модели Kimura-2. Данная модель успешно используется для анализа близкородственных таксонов [3].

На содержание тритерпеновых (ТГ) и стероидных гликозидов (СГ) исследовано 93 образца 46 видов растений из 14 родов (см. табл.). Установлено, что подавляющее большинство изучаемых видов содержит тритерпеновые гликозиды. Стероидные гликозиды обнаружены у представителей родов Trigonella (триба Trifo-lieae), Thermopsis (триба Termopsideae) и Cor-onilla (триба Loteae). Распределение сапонинов двух классов, стероидных и тритерпеновых часто является взаимоисключающим, что может указывать на более экономичное использование защитных ресурсов растений. Тем не менее, в литературе имеются сведения о том, что вид Vicia tenuifolia L. содержит и тритерпеновые, и стероидные гликозиды [4]. Указанный выше факт требует дополнительных исследований, доказывающих возможность одновременного присутствия двух типов сапонинов в растениях.

Таблица. Распространение сапонинов в сем. Fabaceae Lindl.

Таксон	Литературные данные				Экспериментальные данные
	общее кол-во видов	содержат:			общее кол-во видов	содержат:
		ТГ	СГ	сумма		ТГ	СГ
Триба Hedysareae
род Hedysarum L.	6	3	-	3	2	2	-
род Onobrichus Hill.	1	-	-	1	4	4	-
Триба Loteae
род Anthyllis L.	2	1	1	-	1	1	-
род Coronilla	1	-	1	-	1	-	1
Триба Tripholeae
род Medicago L.	9	9	-	-	3	3	-
род Melilotus L.	2	1	1	-	2	2	-
род Tripholium L.	4	3	-	1	9	9	-
род Trigonella L.	5	-	4	1	2	-	2
род Ononis L.	4	-	-	4	-	-	-
Триба Genisteae
род Lupinus L.	1	1	-	-	1	1	-
род Chamaecytisus Link.	1	-	-	1	-	-	-
Триба Phaseoleae
род Phaseolus L.	1	1	-	-	1	1	-
род Glicine Willd	1	1	-	-	-	-	-
Триба Galegeae
род Astragalus L.	24	13	-	11	4	4	-
род Caragana Fabr	4	1	-	3	1	1	-
род Galega L.	2	-	-	2	-	-	-
род Glycyrriza L.	4	4	-	-	-	-	-
род Halimadendron DC.	1	-	-	1	-	-	-
род Oxitropis DC.	9	9	-	-	2	2	-
Триба Vicieae
род Lathyrus L.	1	1	-	-	4	4	-
род Vicia L.	8	8	1	-	4	4	-
род Pisum L.	1	1	-	-	1	1	-
Триба Termopsideae
род Thermopsis R.Br.	1	-	-	1	3	-	3
род Baptisia	1	1	-	-	2	2	-
Сумма	94	58	8	29	47	41	6

Наличие стероидных гликозидов в трибе Trifolieae в роде Trigonella и у вида Melilotus tauricus [5], в трибе Loteae в роде Coronilla и у вида Anthyllis macrocephala [6], а в трибе Ther-mopsideae – только в роде Thermopsis, но не у других представителей этой трибы. Это позволило заметить, что в сем. Fabaceae стероидные гликозиды присущи видам и родам, не связанным монофилитическими отношениями на уровне триб, к которым они принадлежат (рис. 1) и обнаружены только у некоторых филогенетически обособленных таксонов в трибах Loteae, Thermopsideae и Trifolieae. При этом в трибе Trifolieae, как указанно выше, стероидные гликозиды обнаружены только в двух родах (Trigonella и Melilotus), которые на молекулярно-филогенетической кладограмме образуют отдельную кладу, обособленную от других представителей этой трибы, что в свою очередь отражает эволюцию этих таксонов. На данном этапе исследования выявленная нами закономерность не может быть истолкована однозначно. С одной стороны, ее можно объяснить тем, что гены, кодирующие биосинтез ферментов, ответственных за синтез стероидных гликозидов, были приобретены в процессе эволюции в нескольких таксонах, не зависимо друг от друга.

Рис. 1. Филогенетическое древо растений сем. Fabaceae Lindl.

С другой стороны, не исключается гипотеза о том, что эти гены, были приобретены на ранних этапах эволюции цветковых растений, однако их экспрессия происходит только в определенных таксонах, что находит свое отражение и на уровне изучаемого семейства.

Установленный факт, что тритерпеновые гликозиды являются характерными для подавляющего числа видов наследственных Caesalpinioideae /Mimosoideae и большинства триб Papilionoideae, куда входят исследованные нами виды, указывает на генетическую предрасположенность видов сем.

Fabaceae к биосинтезу сапонинов именно этой группы.

Закономерности распространения тритерпеновых и стероидных гликозидов среди представителей сем. Fabaceae использованы нами для составления хемотаксономического прогноза их обнаружения во флоре Европейского Северо-Востока России. Таким образом, большинство видов флоры содержит тритерпеновые гликозиды, стероидные гликозиды можно искать в ограниченных таксонах, указанных выше. Ранее считалось, что не существует связи между распространением экдистероидов и филогенетической классификацией растений, поскольку эк-дистероиды встречаются как в филогенетически близких, так и удаленных семействах. Внутри семейств и даже внутри родов могут встречаться как экдистероидсодержащие, так и лишенные этих соединений виды [7]. Работами сотрудников лаборатории биохимии и биотехнологии Института биологии было показано, что биохимический признак наличия экдистероидов на внутрисемейственном уровне закреплен в трибах, хотя эта закономерность и не носит абсолютного характера. Сказанное относится к концентрациям экдистероидов в растениях, обнаруживаемым с помощью биотеста на культуре клеток Drosophila melanogaster (т.е. гормонально- активным концентрациям по отношению к насекомым). При этом оказалось, что следовые количества экдистероидов, не активные в биотесте, но обнаруживаемые с помощью радиоиммунного анализа в концентрации менее 4 мкг/г содержат едва ли не все виды растений. Это свидетельствует о том, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза экдистероидов присутствуют у всех растений, но их выраженная экспрессия происходит только в группах близкородственных видов, ограниченных определенными родами и трибами, в которых, по-видимому, экдистероиды выполняют экологическую функцию.

В сем. Asteraceae, насчитывающем по разным источникам 20-25 тыс. видов, экдисте-роиды обнаружены только у представителей трибы Cardueae. На основании данных GenBankа нами было построено молекулярнофилогенетическое древо трибы Cardue подсемейства Lactucoideae. Эта триба включает две подтрибы Carduinae (B), виды которой содержат экдистероиды только в следовых количествах, и Centaureinae (A), которая, по данным В.В. Володина и И.Ф. Чадина, включает виды с экологически значимой концентрацией, т.е. «положительные» в биотесте (рис. 2) [8].

Рис. 2. Распространение экдистероидов в семействе Asteraceae :

темная окраска – высокие концентрации, обнаруживаются традиционными методами (положительный ответ в биотесте); более светлая окраска – умеренные концентрации; светлое поле – низкие концентрации, обнаруживаются РИА (отрицательный ответ в биотесте)

LACTUCOIDEAE: Lactuceae: 1 - Hieracium sibiricum , 2 - H . umbellatum , 3 - Leontodon autumnalis , 4 - Picris hei-racioides , 5 - P . hieracioides , 6 - P . umbellatum , 7 - P . umbellatum , 8 - Scorzonera humilis , 9 - Lactuca sativa , 10 - L . tatarica , 11 - Crepis paludosa , 12 - C . praemorsa , 13 - C . sibirica , 14 - C . tectorum , 15 - Taraxacum officinale , 16 - Sonchus asper , Carlineae: 17 - Carlina sp . Cardueae: Carduineae 18 - Arctium tomentosum , 19 - Saussurea latifolia , 20 – S . alpina , 21 - S . parviflora , 22 - Carduus nutans , 23 - Cirsium heterophyllum , 24 - C . oleraceum , 25 - C . palustre , 26 - C . setosum , 27 - C . vulgare , Cardueae: Centaurineae: 28 - Serratula algida , 29 - S . centauroides , 30 - S . coro-nata , 31 - S . inermis , 32 - S . lyratifolia , 33 - S . procumbens , 34 – S . quinquefolia , 35 - S . sogdiana , 36 – S . xeran-themoides , 37 - Rhaponticum carthamoides , 38 - Rh . integrifolium , 39 - Rh . karatavicum , 40 - Rh . lyratum , 41 - Rh . nitidum , 42 - Rh . pulchrum , 43 - Acroptilon repens , 44 - Centaurea scabiosa , 45 - C . rothrokii , 46 - C . phrygia , 47 - C . americana , 48 - C . jacea , 49 - C . fischeri , 50 - Amberboa moschata ;

ASTEROIDEAE: Senecioneae: 51 – Ligularia sibirica , 52 - Petasites spurius , 53 - Cacalia hastata , 54 - Senecio nemoriensis , 55 - S . vulgaris ; Heliantheae: 56 - Bidens cernua , 57 - B . tripartita , 58 - Ambrosia sp .; Inuleae: 59 - An-tennaria dioica , 60 - Omalotheca sylvaticum , 61 - Inula salicina L . Anthemideae: 62 - Achillea millefolium , 63 - A . ptarmica , 64 - Matricaria recutita , 65 - M . suaveolens , 66 - Leucanthemum vulgare , 67 - Artemisia campestris ; As-tereae: 68 - Solidago virgaurea , 69 - Erigeron acris , 70 - E . canadensis

Рис. 3. Филогенетическое древо растений трибы Cardueae сем. Asteraceae Dumort.

Подтриба Centaureinae образует обособленную кладу, включающую две подклады (A1 и A2) с высоким коэффициентом Бутстрепа (рис. 3). Следует отметить, что виды, давшие отрицательную реакцию в биотесте, представлены двумя родами Carthamus и Centaurea и образуют подкладу А1. На молекулярнофилогенетическом древе подкладу А2 образовали виды, давшие положительную реакцию в биотесте и представленные пятью родами: Rhaponticum, Acroptilon, Amberboa, Serratula, Centaurea. Причем в роду Centaurea из 11 исследованных видов – только у представителя C.americana. Другой из исследованных Сарке-ром и Дайнаном в этом роде вид Centaurea mo-schata, в котором было обнаружено высокое содержание экдистероидов [9], по флоре СССР, считается видом другого рода - Amberboa mo-schata, филогенетически близкого роду Acropti-lon. Исходя из данного замечания, уже не кажется неожиданным обнаружение высокой концентрации экдистероидов как в образцах растений Acroptilon repens, так и в Amberboa mo-schata. Полученные данные соответствуют представлению M. Dittrich (1977 год) о разделении на основании палинологических, морфологических и анатомических признаков подтрибы Centaureinae на группы родов, согласно которому Acroptilon входит в одну группу с родами Rhaponticum и Serratula, а роды Carthamus и Centaurea относятся к другой группировке родов [10]. В свою очередь, на построенном нами молекулярно-филогенетическом древе представители родов Acroptilon и Amberboa имеют общего, предположительно, экдистероидсодер-жащего предка. Следовательно, данные распространения фитоэкдистероидов в сочетании с методами молекулярной филогении позволяют выявить существующие филогенетические связи между видами, у которых экдистероиды, возможно, выполняют экологическую роль.

Выводы: использование хемотаксономи-ческого и молекулярно-филогенетического подходов позволило изучить закономерности распространения двух классов вторичных метаболитов в растениях и оценить их значимость в качестве хемотаксономических маркеров и разработать научно обоснованный прогноз поиска ресурсных видов растений – продуцентов вторичных метаболитов мевалонатного пути биосинтеза сапонинов и экдистероидов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Отделения биологических наук РАН «Биологические ресурсы России, оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга» (проект « Состояние ресурсов полезных растений европейского Северо-Востока России: мониторинг и разработка биотехнологических подходов по рациональному использованию и воспроизводству».