Защита миокарда диборнолом в условиях множественной ишемии/реперфузии у крыс

–158

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [1], ишемическая болезнь сердца является основной причиной смертей в мире, составляя 12,2% от общей смертности. После реперфузии страдает сократительная функция миокарда, развиваются микро-циркуляторные нарушения, аритмии и необратимые повреждения миокардиоцитов [2]. Использование ряда лекарственных препаратов позволяет уменьшить размер зоны некроза, улучшить насосную функцию сердца и снизить частоту развития аритмий [3].

Диборнол (2,6-диизоборнил-4-метилфенол) – антиоксидант из группы терпенофенолов, содержащий объемные заместители в орто-положении относительно фенольной гидроксильной группы [4]. Высокая противо-ишемическая активность диборнола, обусловленная его антиоксидантными, гемореологическими, антитром-ботическими и эндотелийпротекторными свойствами, была продемонстрирована в условиях модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга у крыс. Применение диборнола снижало гибель животных и ускоряло восстановление неврологического статуса у выживших животных [5].

Оценка эффективности новых лекарственных средств для лечения ишемических/реперфузионных повреждений необходима в условиях разнообразных моделей ишемии. Модель многократной ишемии миокарда входит в перечень моделей, рекомендуемых при доклиническом исследовании лекарственных средств с противоишемическим (антиангинальным) действием [6] и позволяет оценить способность исследуемых соединений замедлять и уменьшать развитие ишемических изменений в миокарде, а также воздействовать на восстановление функции миокарда во время реперфузионного периода.

Цель данной работы: исследование противоишеми-ческой и антиаритмической активности диборнола при многократной ишемии/реперфузии миокарда у крыс.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на 18 крысах-самцах Вистар массой 270–300 г. Животные содержались в виварии при свободном доступе к воде и пище. Исследования проводились в соответствии с принципами гуманности (Европейская конвенция по защите позвоночных животных, Страсбург, 1986). Животные были разделены на две группы: крысы опытной группы ( n = 9) получали диборнол в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно в виде взвеси в 1%-й крахмальной слизи один раз в сутки в течение четырех дней, последнее введение – за 1 ч до начала эксперимента. Контрольным животным ( n = 9) вводили эквиобъемные количества 1%-й крахмальной слизи в том же режиме.

Моделирование многократной ишемии/реперфузии миокарда проводили в соответствии с методическими рекомендациями [6]. Эксперименты проведены на наркотизированных животных (уретан 1 г/кг, внутрибрюшинно). После оротрахеальной интубации животного подключали аппарат искусственной вентиляции легких Rodent Ventilator 7025 (Италия), проводили торако- и перикардотомию и лигировали левую коронарную артерию на уровне нижнего края auricula sinistra. Концы лигатуры пропускали через полиэтиленовую трубку длиной 10 мм и диаметром 2 мм, при послойном ушивании раны грудной клетки фиксировали ее наружный конец в шве, оставляя концы лигатуры снаружи. При проведении управляемой окклюзии коронарной артерии натягивали концы лигатуры и фиксировали их зажимом, при проведении реперфузии прекращали натяжение лигатуры. Моделировали пять трехминутных эпизодов окклюзии левой коронарной артерии с 15-минутными интервалами реперфузии.

Регистрацию электрокардиограммы (ЭКГ) с использованием компьютерного электрокардиографа «Поли-Спектр-8/Л» проводили во II стандартном отведении. Проводили запись исходной кардиограммы и мониторирование ЭКГ в течение всего эксперимента с определением величины подъема сегмента ST на 1-, 2- и 3-й мин каждого эпизода ишемии и на 5-, 10- и 15-й мин реперфузии. Учитывали качественный характер развивающихся аритмий и их количество: единичных (шесть и менее одиночных) и множественных (более шести одиночных и менее пяти последовательных) желудочковых экстрасистол, эпизодов желудочковой тахикардии (более пяти последовательных циклов эктопической активности, со спонтанной реверсией) и желудочковых фибрилляций.

Статистическую обработку данных проводили на основе пакета программного обеспечения STATISTICA 6.0. Результаты представляли как медиану и интерквартильный размах. При оценке статистической значимости межгрупповых различий применяли критерий Манна – Уитни, смертности и частоты возникновения нарушений сердечного ритма – точный критерий Фишера. Уровень статистической значимости устанавливали при р < 0,05.

Результаты

В контрольной группе смертность в течение всего эксперимента составила шесть животных из девяти взятых в эксперимент (67%): погибло по две крысы после первого, третьего и четвертого эпизодов ишемии/ реперфузии. Гибель животных происходила вследствие развития некупирующейся желудочковой фибрилляции и нарушения системного кровообращения. В опытной группе погибло одно животное из девяти взятых в эксперимент после третьего эпизода ишемии/реперфузии. Показатель смертности в опытной группе (11%) был статистически значимо ниже показателя контрольной группы на 83% ( р = 0,025).

На ЭКГ контрольной группы крыс исходная величина сегмента ST во II стандартном отведении составила 0,15 (0,10; 0,15) мВ. Прекращение кровотока по лигированной коронарной артерии вызывало статистически значимый подъем сегмента ST на 33–133% на протяжении всех пяти эпизодов ишемии миокарда ( р = 0,0001–0,003).

При проведении реперфузии уровень сегмента ST снижался, однако по сравнению с исходной величиной параметра он оставался на повышенном уровне на 67%

( р = 0,002) к концу второй реперфузии, на 87% ( р = 0,001) – к концу третьей и на 33–67% ( р = 0,001–0,006) – к концу четвертой–пятой реперфузии (табл. 1).

Таблица 1. Влияние курсового профилактического введения диборнола в дозе 10 мг/кг на величину подъема сегмента ST во II стандартном отведении ЭКГ (мВ) при моделировании многократной транзиторной ишемии/реперфузии миокарда у крыс

Table 1. The effect of the course-based prophylactic administration of Dibornol at a dose of 10 mg/kg on the ST segment elevation in the standard ECG lead II (mV) in the model of multiple transient myocardial ischemia in rats

Номер эпизода ишемии/		Контроль Control			Диборнол Dibornol
реперфузии Ischemia/			Ишемия Ischemia
reperfusion episode number	1-я мин	2-я мин	3-я мин	1-я мин	2-я мин	3-я мин
	1 min	2 min	3 min	1 min	2 min	3 min
Первый First	0,20 (0,18; 0,33) n = 9	0,25 (0,23; 0,30) n = 9	0,30 (0,25; 0,35) n = 9	0,10+ (0,04; 0,24) р = 0,039 n = 9	0,10+ (0,03; 0,30) р = 0,030 n = 9	0,10+ (0,03;0,25) р = 0,003 n = 9
Второй Second	0,25 (0,15; 0,45) n = 7	0,35 (0,10; 0,45) n = 7	0,35 (0,05; 0,45) n = 7	0,10+ (0,04; 0,15) p = 0,006 n = 9	0,08+ (0,02; 0,17) p = 0,001 n = 9	0,07+ (0,05; 0,17) p = 0,005 n = 9
Третий Third	0,25 (0,22; 0,40) n = 7	0,30 (0,25; 0,40) n = 7	0,30 (0,23; 0,40) n = 7	0,13+ (0; 0,20) p = 0,001 n = 9	0,09+ (0; 0,16) p = 0,001 n = 9	0,10+ (0,03; 0,18) p = 0,001 n = 9
	0,30 (0,23; 0,35) n = 5	0,27 (0,23; 0,36) n = 5	0,27 (0,23; 0,36) n = 5	0,11+	0,12+	0,08+
Четвертый Fourth				(0,05; 0,20) p = 0,006 n = 8	(0,04; 0,20) p = 0,004 n = 8	(0,03; 0,19) p = 0,002 n = 8
	0,30 (0,25; 0,45) n = 3	0,30 (0,25; 0,40) n = 3	0,35 (0,25; 0,35) n = 3	0,10+	0,12+	0,10+
Пятый Fifth				(0,04;0,24) p = 0,025 n = 8	(0,04; 0,25) p = 0,029 n = 8	(0,05; 0,21) p = 0,017 n = 8
	Реперфузия Reperfusion
	5-я мин	10-я мин	15-я мин	5-я мин	10-я мин	15-я мин
	5 min	10 min	15 min	5 min	10 min	15 min
Первый First	0,22 (0; 0,35) n = 8	0,20 (–0,13; 0,33) n = 8	0,13 (0; 0,40) n = 8	0,10+ (0,01; 0,15) p = 0,003 n = 9	0,08+ (0; 0,14) p = 0,001 n = 9	0,05+ (0,04; 0,16) p = 0,002 n = 9
Второй Second	0,30 (0,21; 0,35) n = 7	0,25 (0,20; 0,30) n = 7	0,25 (0,15; 0,30) n = 7	0,13+ (0; 0,20) p = 0,002 n = 9	0,10+ (0,01; 0,20) p = 0,004 n = 9	0,03+ (–0,03; 0,20) p = 0,003 n = 9
Третий Third	0,30 (0,21; 0,30) n = 7	0,30 (0,23; 0,30) n = 7	0,28 (0,23; 0,35) n = 7	0,03+ (0,02; 0,17) p = 0,001 n = 9	0,10+ (0,05; 0,16) p = 0,001 n = 8	0,09+ (0,04; 0,15) p = 0,001 n = 8
	0,25 (0,21; 0,30) n = 5	0,23 (0,20; 0,28) n = 5	0,25 (0,18; 0,30) n = 5	0,12+	0,12+	0,13+
Четвертый Fourth				(0,04; 0,17) p = 0,013 n = 8	(0,05;0,20) p = 0,030 n = 8	(0,04; 0,20) p = 0,044 n = 8
Пятый Fifth	0,20 (0,10; 0,26) n = 3	0,15 (–0,35; 0,26) n = 3	0,20 (–0,40; 0,27) n = 3	0,10 (0,02; 0,17) n = 8	0,10 (–0,02; 0,17) n = 8	0,11+ (–0,11; 0,18) p = 0,042 n = 8

Примечание: + – различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой.

Note: + – the differences are statistically significant compared with the control group.

В опытной группе крыс с профилактическим введением диборнола исходное значение амплитуды сегмента ST во II стандартном отведении ЭКГ не отличалось от значений контрольной группы и составило 0,09 (0,08; 0,13) мВ. Прекращение кровотока в течение 3 мин по лигированной коронарной артерии у этих животных вызывало лишь небольшой подъем сегмента ST (на 11– 44%), не носящий статистически значимого характера по отношению к исходному значению. Подъем сегмента ST был статистически значимо ниже контрольных значений во время всех периодов ишемии. После восстановления кровотока по коронарной артерии в реперфузионный период происходило быстрое восстановление уровня сегмента ST до исходных значений. Различия с контроль- ной группой были статистически значимыми на протяжении первого–четвертого периодов реперфузии и на 15-й мин пятого эпизода (см. табл. 1).

У крыс контрольной группы в течение всех ишемических периодов нарушения ритма желудочков возникли у восьми животных, у двух крыс аритмии не развились. Только единичные желудочковые экстрасистолы были отмечены у двух крыс, множественные желудочковые экстрасистолы без развития тахикардии и фибрилляций зафиксированы у трех крыс. У остальных животных развитие множественных желудочковых экстрасистол сопровождалось появлением либо эпизодов желудочковой тахикардии (одно животное), либо эпизодов желудочковой фибрилляции (одно животное), таблица 2.

Таблица 2. Структура желудочковых аритмий (в % от общего числа животных в группе) у крыс при моделировании многократной транзитор-ной ишемии миокарда

Table 2. The structure of ventricular arrhythmias (% of the total number of animals in the group) in rats in the model of multiple transient myocardial ischemia

Группа животных	БЖА WVA	ЕЖЭ SVE	МЖЭ MVE	ЖТ VT	ЖФ VF
Group of animals			Эпизоды ишемии Ischemia episodes
Контроль, n = 9 Control, n = 9	22	22	33	11	11
Диборнол, n = 9 Dibornol, n = 9	22	44	11	11	11
			Периоды реперфузии
			Reperfusion periods
Контроль, n = 9 Control, n = 9	11	0	11	0	77
Диборнол, n = 9	22	44+	11	11	11+
Dibornol, n = 9		р = 0,041			р = 0,008

Примечание: + – различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой. БЖА – без желудочковых аритмий, ЕЖЭ – единичные желудочковые экстрасистолы, МЖЭ – множественные желудочковые экстрасистолы, ЖТ – желудочковые тахикардии, ЖФ – желудочковые фибрилляции.

Note: + – the differences are statistically significant compared with the control group. WVA – without ventricular arrhythmias, SVE – single ventricular extrasystoles, MVE – multiple ventricular extrasystoles, VT – ventricular tachycardias, VF – ventricular fibrillations.

У крыс опытной группы в периоды ишемии нарушения ритма желудочков отмечены у семи животных, у двух аритмии не развились. Только единичные желудочковые экстрасистолы отмечены у четырех из девяти крыс, взятых в эксперимент. Множественные желудочковые экстрасистолы без тахиаритмий развились у одной крысы, в сочетании с эпизодами желудочковой тахикардии – у одной крысы, в сочетании с эпизодами фибрилляции – у одной крысы (см. табл. 2). Статистически значимых различий между контрольной и опытной группами в частоте возникновения ишемических нарушений ритма не обнаружено.

В контрольной группе во время всех реперфузионных периодов желудочковые аритмии наблюдались у восьми животных, у одного животного аритмии не развились. Множественные желудочковые экстрасистолы при реперфузии отмечены у одной крысы. У остальных семи животных реперфузии сопровождались одновременным развитием множественных желудочковых экстрасистол (более 100 экстрасистол на животное), множественных эпизодов желудочковой тахикардии и фибрилляции (в среднем 13 эпизодов тахикардии и 6 эпизодов фибрилляций на животное).

В опытной группе крыс в реперфузионных периодах аритмии развились у семи из девяти взятых в опыт животных. Только единичные желудочковые экстрасистолы отмечены у четырех крыс, множественные желудочковые экстрасистолы без тахикардии и фибрилляций – у одного животного. Желудочковая тахикардия (два эпизода) в сочетании с множественными (175) желудочковыми экстрасистолами была зарегистрирована у одной крысы. Желудочковые фибрилляции на фоне множественных экстрасистол отмечены у одного животного из группы: некупирующиеся фибрилляции привели к его гибели (см. табл. 2).

При сравнении развивающихся в реперфузионный период аритмий в контрольной и опытной группах был обнаружен отчетливый антиаритмический эффект диборнола. Под влиянием профилактического курсового применения диборнола происходило статистически значимое уменьшение количества животных с фибрилляциями (р = 0,008) и статистически значимое увеличение количества животных с нетяжелыми нарушениями ритма сердца (единичными экстрасистолами), р = 0,041.

Обсуждение

При ишемии/реперфузии сердца источником и одновременно объектом повреждающего действия активных форм кислорода являются митохондрии. При развитии ишемии и дефицита кислорода происходит восстановление переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий, которые при реперфузии и реоксигенации становятся донорами электронов и превращают молекулярный кислород в результате ступенчатого одноэлектронного восстановления в активные формы кислорода с последующими цепными реакциями свободнорадикального перекисного окисления [7]. При ишемии/реперфу-зии вследствие избытка свободных радикалов кислорода [8, 9] наблюдается повреждение сосудов микроциркуля-торного русла сердца, что провоцирует возникновение феномена no-reflow [10, 11]. В свою очередь, уменьшение коронарного кровотока в период реперфузии вызывает появление аритмий и развитие постишемической сократительной дисфункции [12–14]. Реперфузионные нарушения сердечного ритма возникают в момент реоксигенации и обусловлены кальциевым и кислородным парадоксами, а также связаны с повышением тонуса симпатоадреналовой системы, что способствует усилению эктопической активности и триггерного механизма возникновения желудочковых аритмий, а также провоцирует появление петли re-entry и, соответственно, желудочковой тахикардии и фибрилляции [15, 16].

Механизм противоишемического и антиаритмиче-ского эффектов диборнола может быть связан с его способностью оказывать прямой антиоксидантный эффект, особенно при развитии реперфузионного повреждения миокарда. Диборнол обладает прямым антирадикаль-ным эффектом и способен нейтрализовать свободные радикалы путем донации протона, прерывая цепную реакцию липидной пероксидации [4, 5]. Известно, что ис- пользование скавенджеров свободных радикалов приводит к быстрому восстановлению потенциала действия, что улучшает сократительную способность миокарда и уменьшает частоту развития аритмий [8, 17, 18]. Как высоколипофильное соединение диборнол способен включаться в мембраны клеток. Проявлению противо-ишемического и антиаритмического эффектов диборно-ла способствует выявленное при исследовании фармакокинетики препарата свойство накапливаться преимущественно в тканях сердца и мозга, защищая эти органы от ишемического и реперфузионного повреждений [19].