Защита миокарда от ишемически-реперфузионного повреждения посредством подачи оксида азота в контур экстракорпоральной циркуляции при проведении искусственного кровообращения

Кардиохирургическое вмешательство, выполненное в условиях искусственного кровообращения (ИК), сопровождается разнонаправленными изменениями на всех уровнях нервно-рефлекторной регуляции, гуморальной активности и метаболического статуса [1]. Интраоперационная защита органов и тканей, в частности миокарда, по-прежнему остается одним из нерешенных вопросов кардиоанестезиологии. Частота миокардиальной дисфункции в раннем послеоперационном периоде колеблется от 3 до 30% случаев [3] и обусловлена сложным взаимодействием разнообразных механизмов, включающих особый режим обменных процессов в миокарде, свободно-радикальное повреждение, ионный парадокс и эндотелиальную дисфункцию [4].

Одним из перспективных направлений является реализация клинических эффектов феномена прекондиционирования [5, 6]. Ишемическое и фармакологическое прекондиционирование представляет собой эффективный способ повышения резистентности организма к повреждающим воздействиям [7–11]. Однако у больных кардиологического профиля, ввиду возможного усугубления симптомов и сниженных резервов миокарда для защиты сердца от интраоперационной ишемии и реперфузии, наиболее подходящим и безопасным считается фармакологически индуцированное прекондиционирование [12]. При этом в качестве триггера адаптации сердца к ишемически-реперфузионно-му повреждению может выступать оксид азота (NO), запускающий инфаркт-лимитирующее действие через активацию сGMP (циклический гуанозинмонофосфат)-зависимой протеинкиназы G и образование свободных радикалов [13–16]. Стимуляция синтеза NO также играет ключевую роль и в опосредовании феномена эндогенной органопротекции, выступая медиатором поздней фазы цитопротективных эффектов [17].

Цель исследования: изучить эффективность подачи NO в контур экстракорпоральной циркуляции для защиты миокарда от ишемически-реперфузионного повреждения при моделировании острого инфаркта миокарда в условиях искусственного кровообращения.

Методы

Проспективное экспериментальное исследование проводили на 20 кроликах-самцах породы «Советская шиншилла» массой 3–3,5 кг. Все животные были разделены на 2 равные группы: 10 кроликам проводилась подача NO в контур экстракорпоральной циркуляции в дозе 40

ppm на протяжении всего периода ИК (основная группа); 10 кроликов составили контрольную группу. Животных содержали в условиях конвенционального вивария. Все болезненные процедуры и выведение животных из эксперимента осуществляли на наркотизированных животных согласно приказу Минздрава №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» от 1 апреля 2016 г., Принципам надлежащей лабораторной практики ГОСТ 33044-2014 и руководству Janet C. Garber, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition National Research Council, 2011.

Эксперимент начинали с масочной индукции анестезии севофлураном. По достижении целевого уровня анестезии выполняли ретроградную интубацию трахеи по разработанной нами методике эндотрахеаль-ной трубкой № 2,5 (патент № 2611955 от 1 марта 2017 г.), животное фиксировали в положении лежа на спине. Искусственную вентиляцию легких проводили с помощью аппарата искусственной вентиляции легких Puritan Bennett 760 (США) с дыхательным объемом 30–40 мл, частотой дыхательных движений 50–55 в минуту в режиме Controlled Mandatory Ventilation (CMV) с управляемым объемом. Поддержание анестезии обеспечивали севофлураном 1,2–1,5 об% через испаритель Vapor 2000 (Drager, Германия). Использовали стандартный мониторинг анестезии, включавший непрерывный анализ электрокардиографии, инвазивный мониторинг артериального давления, пульсоксиметрию, термометрию с помощью монитора Siemens 7000 (Германия), учет темпа мочеотделения. Для инвазивного измерения артериального давления и забора крови для лабораторного анализа канюлировали бедренную артерию катетером 20G. Для инфузионной терапии канюлировали бедренную вену катетером 20G. Температурный датчик устанавливали в пищевод. Мониторировали показатели сатурации артериальной крови SаО2, сатурации венозной крови из контура искусственного кровообращения SvO2, веноартериальный градиент pCO2, уровень лактата, рассчитывали индекс экстракции кислорода O2EI, а также контролировали кислотно-щелочное состояние крови. Газовый состав крови определяли на приборе STAT PROFILE Critical Care Xpress (Nova Biomedical, США). Забор крови проводили на этапах: до ИК, начало ИК, 45 мин ишемии миокарда, 45 мин реперфузии миокарда, 90 мин реперфузии, 120 мин реперфузии. Также с помощью данного газоанализатора методом отражающей фотометрии контролировали уровень метгемоглобина. Для проведения ИК использовали роликовый насос НПМ-1, неонаталь-

Рис. 1. Веноартериальный градиент pCO₂, 45 мин ишемии, данные представлены как Ме [25; 75]; p = 0,0001

Fig. 1. Venoarterial gradient pCO₂, 45 min ischemia, data are presented as Me [25; 75]; p = 0.0001

ный оксигенатор Kids D100 (Dideco, Италия). Площадь поверхности тела кролика считали равной 0,25 м2. ИК осуществляли в непульсирующем режиме, в условиях нормотермии. Подключение аппарата искусственного кровообращения осуществляли по принятой методике по схеме «аорта – правое предсердие». Перфузионный индекс составлял 1,8 л/мин/м2. Вазоактивные препараты в обеих группах не применяли. В исследуемой группе в магистраль подачи газо-воздушной смеси в асептических условиях встраивали дополнительную линию для доставки NO. Коннектор линии доставки NO был максимально приближен к оксигенатору аппарата ИК и имел бактериальный фильтр. После достижения расчетной объемной скорости перфузии осуществляли подачу NO в контур экстракорпоральной циркуляции в дозе 40 ppm. Дозирование NO осуществляли с помощью анализатора PrinterNOX (CareFusion, США). Затем проводили окклюзию левой коронарной артерии путем пережатия лигатурой на 45 мин с последующей реперфузией в течение 120 мин на фоне ИК. При этом протокол инсуффляции NO сохраняли без изменений на протяжении всего периода искусственного кровообращения.

В группе контроля подачу NO в контур аппарата ИК не проводили. Эксперимент включал окклюзию левой коронарной артерии в течение 45 мин с последующей реперфузией в течение 120 мин в условиях искусственного кровообращения.

Нарушения ритма за период коронароокклюзии регистрировали в первые 10 мин (фаза 1) и последующие 35 мин (фаза 2), поскольку механизмы возникновения аритмий в эти периоды различаются. Фаза 3 — первые 45 мин реперфузии. В фазу 1 нарушения ритма возникают по механизму reentry, в фазу ишемии 2 и при реперфузии — как по механизму reentry, так и при участии эктопического автоматизма [2].

Измерение отношения зоны инфаркта (ЗИ) к области риска (ОР) проводили с помощью модифицированного метода, предложенного J. Neckar [18]. Для определения области риска (гипоперфузии) лигатуру повторно затягивали, сердце окрашивали 5% раствором перманганата калия, который вводили через аортальную канюлю. Сердце извлекали из грудной полости, удаляли правый желудочек и готовили срезы толщиной 1 мм, которые делали строго перпендикулярно продольной оси сердца, используя слайсер HSRABBIT002-1 (Zivic Instruments, Pittsburgh, США)). Срезы сканировали с обеих сторон с помощью HP Scanjet G4050 (Hewlett-Packard, Palo Alto, США) с высоким разрешением (2400 dpi). В области гипоперфузии разграничивали зоны, в которых ткани миокарда подверглись некрозу. Величину ЗИ и ОР определяли

Основная группа / Main group

Контрольная группа / Control group

Рис. 2. Веноартериальный градиент pCO₂, 45 мин реперфузии, p = 0,0016; данные представлены как Ме [25; 75]

Fig. 2. Venoarterial gradient pCO₂, 45 min reperfusion, p = 0.0016; data are presented as Me [25; 75]

компьютеризированным планиметрическим методом, используя оригинальное программное обеспечение. Метод компьютерной планиметрии применяли для измерения общей площади срезов, суммарной площади зоны инфаркта и области риска для каждого сердца в отдельности. Измерение осуществляли с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImageJ2 [19]. Величину очага инфаркта выражали в виде процентного соотношения зоны инфаркта к размеру области риска (ЗИ/ОР).

Статистический анализ

Статистический анализ полученных данных был проведен в программе Statistica 10.0 (StatSoft). Количественные значения выражали как медиану 25-го и 75-го процентилей (Me [25; 75]). Сравнение количественных характеристик проводили с помощью U-критерия Манна – Уитни (для независимых переменных) и T-критерия Уилкоксона (для зависимых переменных). Различия между группами в частоте возникновения желудочковых аритмий оценивали с помощью критерия хи-квадрат. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

У животных обеих групп в течение эксперимента были стабильные показатели метаболизма, кислотноосновной состав крови и ионнограмма: рН, уровни бу- ферных оснований, концентрация лактата, глюкозы, ионов натрия, калия и кальция — находились в пределах референтных значений. При анализе межгрупповых различий отмечено значимое снижение веноартериального градиента pCO2 на этапе 45 мин ишемии (рис. 1), р = 0,0001, и на этапе 45 мин реперфузии, p = 0,0016 (рис. 2).

Снижение веноартериального градиента pCO2 в основной группе было ассоциировано со значимым повышением темпа мочеотделения во время ИК, который составил 1,4 [1,3; 1,5] мл/кг/ч в основной группе и 1,15 [1; 1,3] мл/кг/ч в контрольной, p = 0,013 (рис. 3).

В первые 10 мин ишемии миокарда в основной группе политопные и полиморфные желудочковые экстрасистолы (ЖЭС) наблюдали значимо реже, р = 0,003. В группе контроля чаще отмечены политопные и полиморфные ЖЭС; фибрилляция желудочков развилась у одного животного. В последующие 35 мин ишемии в основной группе животных наблюдали большую электрическую стабильность миокарда, по сравнению с контрольной, р = 0,001. В период реперфузии наблюдали различные виды желудочковых аритмий, статистически значимо меньшее количество политопных и полиморфных ЖЭС наблюдалось в группе NO-протекции, р = 0,012. Фибрилляция желудочков на этапе реперфузии развилась у 4 животных контрольной группы, в основ-

Рис. 3. Темп мочеотделения, мл/кг/ч; p = 0,013

Fig. 3. Urine flow rate, ml/kg/h; p = 0.013

ной группе фибрилляция желудочков не зарегистрирована, р = 0,04 ( таблица ).

Соотношение ЗИ/ОР в основной группе составило 55,6 [50; 61] %, что меньше на 15%, чем у животных контрольной группы — 69,9 [68; 73] %, p = 0,0002 (рис. 4).

Обсуждение

Известно, что NO участвует в реализации различных защитных эффектов адаптации через изменение функционального состояния митохондрий. Возможные механизмы органопротективного действия включают каскады внутриклеточных трансмиттеров с активацией КАТФ-каналов и ингибированием митохондриальных проводящих пор как конечных эффекторов прекондиционирования и снижения повреждения митохондрий при гипоксии/аноксии. Опосредованное NO-угнетение адренергической стимуляции и сократимости с сохранением эндотелий-зависимой вазодилатации и снижением кальциевой перегрузки клеток ведет к уменьшению феномена no-reflow. В исследовании у грызунов установлено, что ингаляция оксида азота приводит к быстрому накоплению метаболитов NO в крови и тканях, способс-

Влияние доставки NO в контур искусственного кровообращения на частоту возникновения аритмий на этапах ишемии и реперфузии

Фаза	Вид нарушения сердечного ритма	Основная группа, n (%)	Контрольная группа, n (%)	p
10 мин ишемии	нет аритмий либо редкие монотопные ЖЭС	5 (50)	6 (60)	0,5
10 мин ишемии	политопные и полиморфные ЖЭС	2 (20)	9 (90)	0,003
10 мин ишемии	фибрилляция желудочков	0	1 (10)	0,5
35 мин ишемии	нет аритмий либо редкие монотопные ЖЭС	5 (50)	6 (60)	0,5
35 мин ишемии	политопные и полиморфные ЖЭС	1 (10)	7 (70)	0,001
35 мин ишемии	фибрилляция желудочков	1 (10)	1 (10)	1
45 мин реперфузии	нет аритмий либо редкие монотопные ЖЭС	5 (50)	4 (40)	0,5
45 мин реперфузии	политопные и полиморфные ЖЭС	2 (20)	8 (80)	0,012
45 мин реперфузии	фибрилляция желудочков	0	4 (40)	0,04

Примечание. ЖЭС — желудочковые экстрасистолы, применен критерий χ ² Пирсона

Рис. 4. Соотношение зоны инфаркта к области риска, данные представлены в % как Ме [25; 75], использован критерий Манна – Уитни; p = 0,0002

Fig. 4. Infarction zone-risk area ratio, the data are presented in % as Me [25; 75], Mann – Whitney test was used; p = 0.0002

твуя кардиопротекции при ишемически-реперфузион-ном повреждении и уменьшению ЗИ/ОР на 31% [20, 21].

Полученные нами данные также свидетельствуют о кардиопротективных свойствах NO при его подаче в контур экстракорпоральной циркуляции при моделировании ишемически-реперфузионного повреждения миокарда. Выявлен инфаркт-лимитирующий эффект со снижением ЗИ/ОР на 15% по сравнению с контрольной группой, а также антиаритмическое действие.

Кардиохирургические пациенты имеют повышенный риск острого повреждения почек и желудочно-кишечного тракта, особенно при необходимости сочетанной операции [22]. Развитие гемолиза вследствие длительного ИК и применения компонентов донорской крови, а также ограничение NO-биодоступности приводят к расстройствам микроциркуляции и системным аберрациям органного кровотока [23].

В исследованиях последних лет доказана безопасность применения оксида азота в течение 24 ч, а также не-фропротективное действие оксида азота, примененного во время ИК и в течение 24 ч после ИК в виде ингаляции, которое проявлялось в снижении развития острого почечного повреждения после кардиохирургических операций в условиях длительного перфузионного периода [24].

По нашим данным, снижение веноартериального градиента pCO2 в основной группе было ассоциировано со значимым повышением темпа мочеотделения во время ИК, что указывает на более выгодный режим кровообращения в органах спланхнического бассейна, в том числе почек во время ИК. Определение оптимального режима дозирования требует дальнейшего изучения.

Выводы

Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют о кардиопротективных свойствах оксида азота при его подаче в контур экстракорпоральной циркуляции при моделировании ишемически-реперфузионно-го повреждения миокарда в виде снижения ЗИ/ОР на 15%, меньшего количества аритмий. Доставка оксида азота в контур экстракорпоральной циркуляции также приводит к улучшению тканевой перфузии во время искусственного кровообращения. Интраоперационная органопротекция миокарда оксидом азота у больных, оперированных в условиях ИК, должна стать объектом дальнейших клинических исследований.

Финансирование

Исследование не имело спонсорской поддержки.