Защитный материал на основе тебуконазола семян «бункер» вызывает синтез дегидринов во время холодного отверждения и повышает морозостойкость посевов пшеницы

Одной из важнейших сельскохозяйственных задач было и остается решение проблемы холодо-, морозо- и зимостойкости возделываемых культур. В настоящее время в сельском хозяйстве активно используются системные фунгициды – ингибиторы C¹⁴-деметилирования, среди которых ведущие позиции занимают азолы, содержащие в своей молекуле триазольную или имидазольную группы. Наибольшее применение получили производные триазола – ингибиторы синтеза стеринов и терпеноидов (Popov et al. , 2003). Производные триазола – ретарданты, которые не только подавляют биосинтез гиббереллина, но и увеличивают содержание эндогенной абсцизовой кислоты (АБК), оказывая, таким образом, ингибирующее влияние на прорастание семян и рост осевых органов растений, имеют ростостимулирующее действие на корневую систему (Prusakova and Chizhova, 1998). Триазолы характеризуются низкой фитотоксичностью по сравнению с другими ретардантами, эффективны в малых дозах и экологически безопасны (Prusakova and Chizhova, 1998).

Увеличение содержания эндогенной АБК рассматривается как один из триггеров низкотемпературной адаптации растений (Titov et al. , 2006). АБК индуцирует синтез стрессовых белков при действии низких температур (Chinnusamy et al. , 2006; Theocharis et al. , 2012). АБК-зависимая экспрессия генов регулируется транскрипционными факторами, которые принадлежат к семействам bZIP, MYC и MYB

(Theocharis et al. , 2012). Одной из основных групп белков при низкотемпературном стрессе является группа COR/LEA - белков (Monroy et al. , 2007; Hara, 2010; Hanin et al. , 2011). Эта группа включает LEA-II белки, к которым относятся дегидрины, содержание которых возрастает при обезвоживании. Благодаря своей гидрофильности и шапероноподобной активности дегидрины предотвращают деградацию и коагуляцию ряда макромолекул клеточных структур при обезвоживании их внеклеточным льдом (Skriver and Mundy, 1990; Goyal et al. , 2005). Кроме этого, дегидрины проявляют криопротекторную, антифризную и антиоксидантную активности (Rorat, 2006; Hara, 2010; Hanin et al. , 2011). Показано, что содержание дегидринов увеличивается при закаливании растений в осенний период и снижается во время деакклимации весной (Bubjakina et al. , 2011; Petrov et al. , 2011; Ponomarev et al., 2014).

Одним из представителей соединений триазолиевого ряда является тебуконазол (1-(4-хлорфенил)-4,4-диметил-3-(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)-3-пентанол). Тебуконазол обладает профилактическим и лечебным системным действием, эффективен против всех видов ржавчины зерновых культур, подавляет головнёвые грибы, возбудителей корневых гнилей и плесневения семян (Popov et al., 2003). Учитывая, что производные триазола обладают ретардантным действием и повышают содержание эндогенной АБК, можно предположить, что эти вещества будут влиять на синтез стрессовых белков и холодо- и морозоустойчивость растений.

Тебуконазол-содержащий препарат «Бункер» (содержание тебуконазола составляет 60 г/л) является системным фунгицидом профилактического и лечебного действия для протравливания семян зерновых культур против семенной и почвенной инфекции (производитель ЗАО Фирма «Август»). В настоящей работе изучалось влияние обработки семян препаратом «Бункер» на синтез дегидринов при холодовом закаливании и морозоустойчивость проростков озимой и яровой пшеницы.

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали этиолированные проростки мягкой яровой (сорт «Новосибирская 29») и озимой (сорт «Иркутская») пшеницы ( Triticum aestivum L.). Обработку семян протравителем проводили непосредственно перед их размещением на подложки кювет. Для обработки использовали водный раствор препарата «Бункер» разной концентрации (0,5, 1, 1,5, 3, 4 и 5 литров на тонну семян, л/т). В лабораторных экспериментах проводили пересчёт на вес семян в граммах (мкл/г).

Для определения степени ингибирования роста и жизнеспособности клеток колеоптилей семена проращивали в течение 5-ти суток на влажной фильтровальной бумаге при 24 °С в темноте. Степень ингибирования роста побегов этиолированных проростков злаков (I, %) определяли согласно (Ivanov, 1974), замеряя длину колеоптилей 5-ти суточных проростков, выращенных из необработанных (контроль) и обработанных препаратом «Бункер» семян.

Для определения жизнеспособности клеток колеоптилей использовали метод восстановления красителя 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) (Enikeev et al., 1995). Для этого колеоптили 5-ти суточных проростков злаков (0,1 г) инфильтровали раствором K-Na фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,5% ТТХ, и инкубировали в анаэробных условиях при 26 °C в течение 12 ч в темноте. Затем краситель удаляли 3х кратным промыванием дистиллированной водой. Продукт восстановления ТТХ – формазан экстрагировали 96%-м этиловым спиртом в течение 15 мин при 60 °C. Концентрацию формазана рассчитывали по оптической плотности раствора при 490 нм. Расчёт проводили в относительных единицах (отн. ед.) на 1 г сырого веса (восстановление ТТХ, A 490 /г сырого веса). Контролем служили колеоптили 5-ти суточных этиолированных проростков, гибель которых вызывали кипячением в течение 15 мин.

Холодовому закаливанию подвергали 3-х суточные этиолированные проростки пшеницы, выращенные из необработанных и обработанных препаратом «Бункер» семян. Закаливание проводили в темноте при температуре 2 °С в течение 7-ми суток в камере тепла/холода MKT-240 (ЦКП Фитотрон СИФИБР СО РАН). Закалённые проростки промораживали при температурах –2, – 4, –6, –8, –10 °С (снижение температуры происходило со скоростью 1 °С/ч один раз в сутки). После этого температуру повышали, моделируя условия раззакаливания: –8, –6, –4, 0, 4 °С (продолжительность обработки каждой температурой составляла 24 ч за исключением обработок температурами –8 и 4 °С, которые длились 12 ч). Для изучения изменений в синтезе дегидринов отбирали побеги до закаливания (контроль в возрасте 3-х суток), закаленные в течение 7-ми суток при 2 °С и подвергнутые раззакаливанию 4 °С в течение 12 ч.

Для оценки морозоустойчивости проростков закалённые этилированные проростки из необработанных и обработанных препаратом «Бункер» семян промораживали при температуре -7 °С в течение 24 ч. Затем проростки оттаивали при 2 °С в течение суток, после чего оставляли растения отрастать в темноте при 24 °С в течение 3-х – 7-ми суток. Количество выживших после промораживания проростков выражали в процентах от общего числа проростков.

Выделение общего белка из побегов проростков озимой и яровой пшеницы проводили по ранее описанной методике (Pobezhimova et al., 2004). Содержание дегидринов в побегах изучали с помощью электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и вестерн-блоттинга (Pobezhimova et al., 2004) с поликлональными антителами против дегидринов (антитела против синтетического пептида, содержащего последовательность KIKEKLPG, являющуюся частью уникального К-сегмента дегидринов) (ADI-PLA-100, “StressGen”, США). Использовали вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, а детекцию белков проводили с 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфатом и нитротетразолием синим.

Проводили не менее трёх независимых экспериментов. На рисунках 1, 2 и 4 представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения. На рисунке 3 представлены типичные иммуноблоты. « n » (в подписях к рисункам) означает количество независимых экспериментов.

RESULTS AND DISCUSSION

Ретардантный эффект тебуконазол-содержащего протравителя семян «Бункер» и отсутствие его фитотоксичного эффекта

Для подтверждения данных, имеющихся в литературе, относительно наличия у тебуконазола ретардантных свойств (Prusakova and Chizhova, 1998), было изучено влияние протравителя «Бункер» на длину колеоптилей этиолированных проростков яровой и озимой пшеницы. Одновременно с изучением ретардантных свойств препарата «Бункер» проводили подбор его рабочей концентрации для дальнейших исследований. В инструкции по применению данного препарата рекомендованная концентрация для достижения фунгицидного эффекта составляет 0,5 л/т, возможно, что для проявления ретардантных свойств концентрация препарата «Бункер» будет несколько отличаться от рекомендованной для применения в качестве фунгицида.

Действительно, обработка семян препаратом «Бункер» сопровождалась ингибированием длины колеоптилей яровой и озимой пшеницы, при этом степень ингибирования роста возрастала с увеличением концентрации препарата. Так, препарат «Бункер» приводил к ингибированию длины колеоптилей проростков яровой пшеницы и озимой пшеницы в концентрации 0,5 л/т на 28 и 30%, в концентрации 1 л/т – на 33 и 36%, в концентрации 1,5 л/т – на 42 и 40%, в концентрации 3 л/т – на 47 и 43%, в концентрации 4 л/т – на 51 и 48%, а в концентрации 5 л/т – на 56 и 53%, соответственно (рис. 1). Эти данные подтверждают, что тебуконазол-содержащий протравитель семян «Бункер» является ретардантом и оказывает концентрационнозависимое ингибирующее действие на рост побегов озимой и яровой пшеницы.

Чтобы определить безопасность использования протравителя семян «Бункер» для растений яровой и озимой пшеницы в концентрации выше рекомендованной производителем, далее была изучена жизнеспособность клеток колеоптилей изучаемых злаков. Величина восстановления ТТХ, которая наблюдалась в колеоптилях 5-ти суточных проростков злаков, подвергнутых кипячению, считалась значением, характеризующим «погибшие» растения. Как оказалось, обработка семян препаратом «Бункер» в концентрациях 1,5, 3, 4 и 5 л/т не приводит к гибели клеток колеоптилей озимой и яровой пшеницы (рис. 2). Наоборот, с повышением концентрации препарата наблюдается увеличение восстановления ТТХ в клетках, что свидетельствует о том, что жизнеспособность клеток колеоптилей выше, по сравнению с колеоптилями проростков из необработанных семян. Наблюдаемое нами отсутствие гибели клеток колеоптилей озимой и яровой пшеницы соответствует данным, имеющимся в литературе, характеризующим производные триазола как ретарданты, обладающие низкой фитотоксичностью (Mel’nikov et al., 1995; Prusakova and Chizhova, 1998). На основании результатов по увеличению степени восстановления ТТХ в клетках колеоптилей из проростков, выращенных из семян, обработанных препаратом «Бункер», можно предполагать, что обладая ретардантными свойствами, тебуконазол не только замедляет процессы роста, но и отодвигает сроки старения. В этом случае обработка семян злаков тебуконазол-содержащим препаратом «Бункер» привела к замедлению роста растений и торможению программы старения и по своим физиолого-биохимическим параметрам проростки из обработанных препаратом «Бункер» семян не соответствовали 5-ти суточным проросткам из необработанных семян. При этом, чем более выраженный ретардантный эффект оказывал препарат на проростки яровой и озимой пшеницы (рис. 1), тем выше была жизнеспособность клеток колеоптилей этих проростков (рис. 2). Ранее нами было показано, что гибель клеток колеоптилей этиолированных проростков злаков (кукурузы и озимой пшеницы) происходит на 5-6-ые сутки роста (Korsukova et al., 2013a, b). Возможно, поэтому жизнеспособность клеток колеоптилей 5-ти суточных проростков озимой и яровой пшеницы из необработанных семян была ниже жизнеспособности клеток колеоптилей злаков этого же биологического возраста, выросших из обработанных препаратом «Бункер» семян.

В дальнейшем в качестве рабочей концентрации протравителя «Бункер» была выбрана концентрация 1,5 л/т.

Индукция синтеза дегидринов и повышение морозоустойчивости пшеницы после обработки семян препаратом «Бункер»

Синтез стрессовых белков является одним из механизмов низкотемпературной адаптации растений (Chinnusamy et al., 2006; Trunova, 2007 Hanin et al., 2011). Закаливание индуцировало синтез дегидринов в побегах этиолированных проростков озимой и яровой пшеницы (рис. 3). В проростках озимой пшеницы после закаливания обнаруживались дегидрины с относительными молекулярными массами 209, 200, 70, 55, 51, 43, 34, 33, 17, 16 и 15,7 кДа. В побегах проростков озимой пшеницы, выросших из семян, обработанных протравителем «Бункер», при закаливании наблюдали появление новых полипептидов с относительными молекулярными массами 27, 25, 22, 21, 19 и 18,6 кДа (рис. 3). Наиболее значительно индуцировался полипептид с молекулярной массой 27 кДа. Моделируя условия раззакаливания обнаружено, что в побегах проростков озимой пшеницы, выращенных из обработанных препаратом «Бункер» семян, дегидрины с молекулярными массами 27, 25, 22, 21 и 19 кДа продолжали присутствовать и в период раззакаливания.

С помощью антител против дегидринов в побегах этиолированных проростков яровой пшеницы после закаливания обнаруживались полипептиды с относительными молекулярными массами 209, 200, 70, 56, 51, 43, 32, 12,3 и 11,5 кДа (рис. 3). Обработка семян протравителем «Бункер» приводила к появлению при закаливании в побегах яровой пшеницы трех новых полипептидов с относительными молекулярными массами 19, 27 и 28,5 кДа, при этом полипептид с молекулярной массой 27 кДа индуцировался значительнее других. После раззакаливания проростков полипептид с молекулярной массой 27 кДа продолжал детектироваться в побегах яровой пшеницы (рис. 3).

Торможение ростовых процессов и синтез дегидринов являются одними из механизмов, способствующих повышению устойчивости растений к низким неблагоприятным температурам (Trunova, 2007; Kosulina et al., 2011). Поскольку обработка семян как озимой, так и яровой пшеницы протравителем «Бункер» приводила к ингибированию роста побегов (рис. 1), а также индуцировала синтез ряда дегидринов (рис. 3), то возможно, что обработка препаратом «Бункер» будет влиять и на морозоустойчивость этих зерновых культур.

Чтобы выяснить данное предположение, проанализировали выживаемость холодозакалённых проростков озимой и яровой пшеницы, выращенных из необработанных и обработанных препаратом «Бункер» семян, после их промораживания при -7 °С в течение 24 ч. Оказалось, что выживаемость проростков из необработанных семян при данной температуре составляет 30% для яровой пшеницы и 70% для озимой пшеницы (рис. 4). В то же время выживаемость проростков, выращенных из семян, обработанных препаратом «Бункер» в концентрации 1,5 л/т, значительно выше и составляет 84,5% для яровой пшеницы и 95% для озимой пшеницы (рис. 4).

Концентрация препарата “Бункер”, л/т

Figure 1. Ингибирование длины колеоптилей, вызванное обработкой семян озимой и яровой пшеницы препаратом «Бункер». В качестве контроля использовали колеоптили 5-ти суточных проростков, выращенных из семян, необработанных препаратом «Бункер». n =4. M±S.D.

Концентрация препарата “Бункер”, л/т

Figure 2. Влияние обработки семян препаратом «Бункер» на жизнеспособность клеток колеоптилей озимой и яровой пшеницы

Обозначения : погибшие колеоптили – колеоптили 5-ти суточных проростков злаков, подвергнутых кипячению контроль 5 сут – колеоптили 5-ти суточных проростков злаков, выращенных из необработанных препаратом «Бункер» семян. n =3. M±S.D.

Figure 3. Влияние обработки семян препаратом

Бункер» на синтез дегидринов в побегах

проростков озимой и яровой пшеницы, подвергнутых закаливанию и раззакаливанию

Обозначения : М – белковые маркеры (кДа); К – проростки, выращенные из необработанных семян (контрольные проростки); Б – проростки, выращенные из семян, обработанных препаратом «Бункер» (1,5 л/т); До зак – проростки до закаливания (24 ºС, 3 суток); Зак – 3-х суточные проростки, подвергнутые закаливанию (2 °С, 7 суток); Раззак – закалённые проростки, подвергнутые ступенчатому промораживанию при –2, –4, –6, –8, –10 °С и раззакаливанию при –8, –6, –4, 0, 4 °С (продолжительность воздействия представлена в методике). n =3.

Figure 4. Влияние обработки семян препаратом «Бункер» на выживаемость проростков озимой и яровой пшеницы после действия отрицательной температуры -7 °С (24 ч)

Обозначения : хол.зак. – холодозакалённые проростки, выращенные из необработанных семян, хол.зак. (Б) – холодозакалённые проростки, выращенные из семян, обработанных препаратом «Бункер» (1,5 л/т). n=3. M±S.D.

Таким образом, обработка семян озимой и яровой пшеницы препаратом «Бункер» – фунгицидом триазольной природы, содержащим в качестве действующего вещества тебуконазол, приводит к ингибированию роста побегов, к синтезу в побегах специфических дегидринов и к повышению морозоустойчивости проростков. Можно полагать, что наблюдаемые в работе эффекты от обработки семян озимой и яровой пшеницы препаратом триазольной природы обусловлены влиянием производных триазола на содержание в клетках АБК (Prusakova and Chizhova, 1998). Вероятно, что действие производных триазола на растительные клетки носит комплексный характер и не ограничивается их влиянием только на изученные параметры, что требует дальнейшего изучения.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что тебуконазол-содержащий препарат «Бункер» повышает устойчивость растений к низкой температуре, влияя на ростовые процессы и синтез стрессовых белков.