Зависимость роста побегов и корней, а также содержания и метаболизма цитокининов от чувствительности растений арабидопсиса к этилену

камере при освещенности 120 μмоль фотонов/(м2 с), температуре 23оС днем и 19оС ночью, продолжительности светового периода 16 ч.

После прорастания семян относительную влажность песка поддерживали на уровне 65%.

В возрасте 28 сут у растений определяли сырую массу побегов и корней и фиксировали их в 80%-ном этаноле для экстракции цитокининов.

Экстракцию, очистку и концентрирование цитокининов проводили как описано ранее [11]. Концентрацию цитокининов в побегах и корнях растений определяли с помощью твердофазного имму-ноферментного анализа, используя антитела к рибозиду зеатина, имеющие также высокую кроссреактивность к зеатину и зеатиннуклеотиду [12].

Для определения активности цитокининоксида-зы использовали метод деградации изопентенила-денозина (ИПА) в присутствии белкового экстракта из растительной ткани.

Растительный материал гомогенизировали в холодном (6°С) 0.1М имидазол(HCl-буфере (pH 7.1). Гомогенат центрифугировали при 12 000 g в течение 25 мин. Белки из супернатанта осаждали добавлением равного объема насыщенного раствора (NH 4 ) 2 SO 4 и центрифугировали при 5000 g в течение 15 мин. Осадок ресуспензировали в имидазол-HCl-буфере (pH 7.1). Далее 50 мкл препарата добавляли к 50 мкл смеси, содержавшей стандарт ИПА и имидазол(HCl-буфер (pH 7.1) в конечной концентрации 0.04(0.06 М. Для контроля в смесь вместо белкового препарата добавляли 50 мкл соответствующего буфера.

Реакционные смеси инкубировали в термостате при 37°С в течение 3 ч. Реакцию останавливали добавлением 0.2 мл холодного этанола, и смесь центрифугирование при 5000 g в течение 10 мин. Содержание ИПА в супернатанте оценивали с помощью иммуноферментного анализа в тест-системе для определения изопентениладенози-на/изо-пентениладенина [13].

Статистическую обработку проводили по стандартным программам MS Excel.

На рисунках и в тексте представлены средние значения и стандартная ошибка показателей из трех и более биологических повторов (n).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что этилен является ингибитором роста корней в длину [10, 14].

Это подтверждается в нашем опыте: корни нечувствительных к этилену мутантных растений были длиннее, чем у растений исходной линии (табл.).

Масса корней у мутантных растений была достоверно меньше, чем у растений исходной

Таблица. Длина корней, масса сырого вещества побегов и корней, соотношение массы побег/корень 28дневных растений арабидопсиса ( Arabidopsis thaliana ) дикого типа (COL) и их этиленнечувствительных мутантов (ETR-1), n = 30

Показатель Линии арабидопсисов COL ETR-1 Длина корней, мм 84,94±5,08 100,4±6.09 Масса побегов, г 0,042±0,006 0,037±0,004 Масса корней, г 0,025±0,003 0,012±0,001 Соотношение массы побег/корень 1,689 3,125 линии. Следовательно, можно предполагать, что этилен, хотя и ингибирует удлинение корней, в то же время необходим для поддержания накопления их биомассы.

Потеря чувствительности растений к этилену не влияла на накопление массы побегов (табл.). Таким образом, у нечувствительных к этилену растений наблюдалось увеличение соотношения массы побега и корня, что свидетельствует об относительной активации роста побега по сравнению с корнями у мутантных растений в сравнении с исходными (табл.).

Такая реакция является характерным ответом растений на цитокинины [15, 16]. Важно то, что по сравнению с растениями исходного генотипа у мутантных растений мы действительно наблюдали повышение содержания цитокининов, особенно ярко выраженное в их корнях (рис. 1).

Рис. 1. Содержание цитокининов в побегах и корнях 28-дневных растений арабидопсиса дикого типа (COL) и их этиленнечувствительных мутантов (ETR-1), n = 3

В литературе есть сведения о способности этилена активировать распад цитокининов [6]. Поэтому неудивительно, что мы обнаружили повышенное содержание цитокининов у растений, нечувствительных к этилену. Известно, что избыточные концентрации цитокининов подавляют рост и раз- витие корневой системы [17]. Можно было предполагать, что этилен способствует накоплению биомассы корней растений через нормализацию уровня цитокининов и предотвращение их чрезмерного накопления.

Известно, что распад цитокининов катализирует фермент цитокининоксидаза [13, 18] Мы оценили активность этого фермента у растений двух генотипов. В наших экспериментах активность цитоки-ниноксидазы у нечувствительных к этилену растений также была выше, чем у растений исходного типа (рис. 2). Поэтому более высокое содержание цитокининов у растений потерявших чувствительность к этилену не могло быть следствием изменения активности цитокининоксидазы. Скорее оно могло быть его причиной. По литературным данным активность цитокининоксидазы может повышаться вслед за увеличением концентрации эндогенных цитокининов [18]. Следовательно, и в наших экспериментах происходила субстратная регуляция активности фермента. Снижение уровня цитокининов под влиянием этилена могло быть связано с необратимой конъюгацией цитокининов или ингибированием их синтеза.

Наши результаты помогают лучше понять механизм действия цитокининов на рост корней. По данным литературы, эти гормоны тормозят как накопление биомассы, так и удлинение корней [17]. Однако в наших опытах у мутантных растений, потерявших чувствительность к этилену, накопление цитокининов в корнях не сопровождалось торможением их удлинения. Наоборот, они были длиннее, чем у растений исходной линии. Следовательно, наши результаты подтверждают, что способность цитокининов подавлять удлинение корней осуществляется через этилензависимый каскад [19]. Вместе с тем, цитокинины подавляли накопление биомассы корней у нечувствительных к этилену мутантов. Эти результаты указывают на то, что это свойство цитокининов является этилен независимым.

Рис. 2. Активность цитокининоксидазы в побегах и корнях 28-дневных растений арабидопсиса дикого типа (COL) и их этиленнечувствительных мутантов (ETR-1), n = 3

Таким образом, этилен способен ингибировать удлинение корней, однако он, по-видимому, необходим для поддержания накопления массы корней. Это может быть связано с его способностью ограничивать накопление цитокининов в растениях. С другой стороны, снижение прироста массы корней у нечувствительных к этилену растений на фоне повышенного содержания эндогенных цитокининов может говорить о том, что ингибирующее влияние цитокининов на этот процесс, по-видимому, не связано с этиленовым сигналингом.