Значение белковых компонентов в разнокачественной икре для эмбрионального развития и жизнестойкости личинок карповых рыб

Изучение биохимической разнокаче-ственности половых продуктов в условиях искусственного воспроизводства, несомненно, важно для совершенствования методов оценки качества производителей и получаемого потомства, поскольку именно в динамике состава яйцеклеток и сперматозоидов реализуются изменения обмена веществ производителей в период гаметогенеза, созревания и нереста. При искусственном разведении карпа и растительноядных рыб отличительной особенностью технологического цикла является быстрая потеря способности икры к оплодотворению (от 0,5 до 1,5 часов) по сравнению с моментом овуляции. Качество получаемой икры оказывает существенное влияние на количественные характеристики эмбрионального развития в период инкубации и выживаемость не питающихся личинок. Именно поэтому возни- кает необходимость перехода к оценке икры по биохимическим показателям, которые дают более точную информацию о способности к оплодотворению и нормальному развитию. Можно десятилетиями работать над созданием новой породы с наилучшим экстерьером и свести на нет все усилия лишь из-за несвоевременного отцеживания половых продуктов или неудачного осеменения в условиях искусственного воспроизводства.

У рыб как многоплодных животных (имеющих большую плодовитость) в условиях искусственного разведения влияние самцов на жизнеспособность потомства гораздо слабее, чем самок. Это объясняется тем, что макромолекулы, имеющиеся в зрелых ооцитах и синтезированные в ходе развития, способны гораздо дольше обеспечивать развитие потомства по сравнению с ядром и цитоплазмой сперматозоидов. Использование для искусственного осеменения высококачественной спермы 3–6 самцов не только увеличивает внутривидовую гетерогенность потомства, усиливая тем самым генетический полиморфизм популяций, но и сводит к минимуму возможность выделения «отцовского фактора» в разнокачествен-ности потомства [5].

Объекты и методы исследования. Экспериментальный материал получен в 1990–2004 гг. в рыбоводных хозяйствах Астраханской и Волгоградской областей (V и VI зоны рыбоводства). Объектами исследований послужили зеркальный и чешуйчатый карп, белый амур (БА) и пестрый толстолобик (ПТ) из местных пользовательных стад, а также сазан и пестрый толстолобик, заготовленные на тонях Нижней Волги. В ходе анализа нами были выделены следующие группы икры в соответствии с ее рыбоводным качеством:

Группа I – «недозрелая» икра. Соответствует подфазе Е1 – незавершенной IV стадии зрелости гонад (СЗГ). У сазана и карпа характеризуется малым количеством полостной жидкости («густая» икра) и отцеживается малыми порциями. При обесклеива-нии образует трудно разбиваемые комки. У растительноядных рыб овариальной жидкости, наоборот, много, икринки мелкие и упругие на ощупь.

На контрольных гистологических препаратах и у карпа, и у растительноядных рыб не у всех самок в такой икре отмечен заметный сдвиг ядра к оболочке. Развитие осемененной икры характеризуется появлением разноразмерных бластомеров, большим количеством уродливых эмбрионов, погибающих задолго до вылупления. Процент оплодотворения низкий, не превышает 50 %, процент нормально развивающихся эмбрионов близок к нулю. У растительноядных рыб вылупившихся предличинок не отмечено, у сазана наблюдается единичный выклев.

Группа II и III – «зрелая икра», соответствующая IV завершенной СЗГ и подфазе Е2. Отцеживание икры быстрое. После оплодотворения дробление синхронное и равномерное, уродливых эмбрионов мало. К группе II (икра хорошего рыбоводного качества) отнесена икра с процентом оплодотворения 50–70 %, высоким процентом нормально развивающихся эмбрионов (80–90 %) и близким к нормативному процентом выхода предличинок (от 30 до 60 %). В группу III (икра отличного рыбоводного качества) выделена икра с максимальной оплодотворяемостью (более 70 %), наиболее высокими показателями нормально развивающихся эмбрионов (от 80 до 100 %) и выхода предличинок (более 60 %). Группы, следовательно, выделены по отношению к важнейшим рыбоводным характеристикам, выявляемым в ходе инкубации.

Группы IV и V – «постовулярно перезревшая икра» (передержанная в полости тела самок после овуляции при несвоевременном отцеживании). Соответствует IV СЗГ и IV– VI СЗГ. Характеризуется большими и заметно набухшими, легко деформируемыми при нажатии икринками, среди которых встречаются уже побелевшие. Дробление асинхронное, бластомеры разной формы часто отрываются от бластодиска. Процент оплодотворения может быть и низким, и высоким, но из-за множества уродливо развивающихся эмбрионов процент выхода предличинок незначителен (5–10 %). К группе IV отнесена икра, еще сохранившая способность к оплодотворению (подфаза Е2), а к группе V – полностью ее утратившая (подфазы Е3 – F). У сазана и карпа до 10 % икринок такую способность сохраняют вследствие субпорционного характера созревания ооцитов и выметывания икры.

Количество общего белка в икре определяли по Lowry et al. [9], а в полевых условиях – по биуретовой реакции [1]; фракционный состав белков – методом электрофореза в блоке 5 %-ного полиакриламидного геля в сравнении с параллельной разгонкой маркеров – белков сыворотки крови человека, яичного овальбумина и бычьего альбумина. b -ли-попротеиды в гомогенате икры – по Бурштейну и Самаи [там же].

Взаимосвязи между биохимическим составом икры, с одной стороны, и показателями эмбрионального развития и жизнестойкостью не питавшихся личинок – с другой, изучались с помощью статистического, корреляционного и регрессионного анализа.

Полученные результаты . Показателем, устойчиво связанным с качеством икры БА и

ПТ, является содержание общего белка. Существует немало видов, у которых данный параметр обнаруживает те или иные взаимосвязи с рыбоводными характеристиками развивающейся икры, и прежде всего – с ее оплодотворяе-мостью. Наибольшее его содержание у всех изученных нами видов нами отмечено в зрелой икре хорошего и отличного качества (табл. 1 и 2). Следует отметить, что при экзогенном стимулировании созревания в период, непосредственно предшествующий овуляции, продолжается поступление в яйцеклетки различных органических и неорганических соединений – об этом свидетельствует динамика биохимического состава недозрелой и зрелой икры (соответственно I, II и III группы).

Постовулярное перезревание икры сопровождается началом протеолиза, что вызывает уменьшение содержания белка, все более заметное по мере углубления процессов дегенерации. Перезрелая икра, сохраняющая способность к оплодотворению (IV группа), имеет относительно высокий уровень белка; икра, полностью утратившая такую возможность (V группа), характеризуется самым низким его уровнем (табл. 1–

2). Такие тенденции характерны для всех трех видов и по всем годам исследований.

Корреляционный анализ подтвердил существование достоверных связей между содержанием общего белка в овулировавшей икре двух видов растительноядных рыб с основными показателями эмбрионального развития и длиной вылупившихся предличинок (см. табл. 3). У сазана же не удалось выявить достоверных связей с рыбоводными показателями инкубации ни для одного биохимического параметра – у этого вида, сохраняющего в экологических условиях Нижневолжского региона субпорционность икрометания, при искусственном воспроизводстве показатели эмбрионального развития связаны с массой овулировавших икринок. Для белого амура и пестрого толстолобика, имеющих единовременное икрометание, содержание белка в овулировавшей икре может быть использовано в виде биохимического критерия качества, тем более что методика его определения по биуретовой реакции несложна, не требует дефицитного оборудования и реактивов и вполне применима в полевых условиях.

Таблица 1

Содержание белка в разнокачественной икре (% сырой массы), 2001–2002 гг.

Виды рыб	Группы икры	2001 г.	2002 г.
Сазан ( n = 36)	I	18,90 ± 0,94	20,27 ± 0,30
	II–III	21,05 ± 0,91	21,47 ± 0,40
	IV–V	16,97 ± 0,70	19,10 ± 1,32
Белый амур ( n = 29)	I	19,30 ± 1,01	17,57 ± 1,29
	II–III	21,23 ± 0,39	18,81 ± 0,79
	IV–V	17,50 ± 0,69	16,90 ± 0,42
Пестрый nолстолобик ( n = 30)	I	18,21 ± 0,82	18,40 ± 0,49
	II–III	20,28 ± 0,76	21,79 ± 0,67
	IV–V	16,29 ± 0,81	15,52 ± 0,77

Таблица 2

Белок в разнокачественной икре карповых рыб (% сырой массы), 2003 г.

Группы икры	Сазан ( n = 35)	Белый амур ( n = 38)	Пестрый толстолобик ( n = 41)
I	18,74 ± 1,18	18,54 ± 0,18	20,04 ± 0,89
II	20,24 ± 1,20	19,93 ± 0,96	19,69 ± 0,77
III	20,23 ± 0,34	20,74 ± 0,51	20,53 ± 0,52
IV	19,54 ± 1,39	20,60 ± 1,59	19,12 ± 0,64
V	19,01 ±1,23	17,16 ± 0,84	18,15 ± 1,34
Резорбирующаяся икра (48 часов после овуляции)	8,52 ± 0,92	13,64 ± 1,09	11,10 ± 0,84

Регрессионный анализ подтверждает взаимосвязь параметров эмбрионального развития с ростом количества белка в овулировавшей икре (см. рис. 1–3).

Однако при анализе электрофоретического спектра белков нам не удалось выявить взаимосвязей между содержанием отдельных фракций и характеристиками эмбрионального развития. Это может означать, что для полноценного развития эмбрионов и личинок важен весь белковый пул в овулировавшей икре.

Значительная роль в процессах созревания гонад и построении мембран яйцеклеток и развивающихся зародышей рыб принадлежит липопротеидам. Среди них наиболее важны b-липопротеиды - белково-липид-ные комплексы с подвижностью b—глобулинов (по современной классификации – липопротеиды низкой плотности, ЛПНП). Они часто встречаются в крови половозрелых самок в период вителлогенеза, перенося в развивающиеся ооциты липовителлин – комплекс, содержащий, помимо белков и липидов, также фосфор и кальций [4]. Изучению динамики b-липопротеидов в крови рыб посвящено немало работ (см.: [2] и др.), но данных по содержанию этих соединений в икре мы не встретили.

Как показали наши исследования, в икре сазана содержится значительно больше b —ли-попротеидов, чем у белого амура и пестрого толстолобика (см. рис. 4). Количественное определение показывает, что в недозрелой и зрелой икре (I, II и III группы) концентрация b -ли-попротеидов меняется незначительно (Р > 0,5). Передержка икры после овуляции, даже при сохранении оплодотворяемости (IV группа), вызывает значительное снижение уровня b -липоп-ротеидов только у белого амура (P < 0,05), у других видов различия несущественны (P > 0,5). Лишь сильное постовулярное перезревание, сопровождающееся полной потерей способности к оплодотворению (V группа), связано со значительным падением содержания b -липоп-ротеидов у всех трех рассматриваемых видов (P < 0,05). Это согласуется с увеличением ко-

Таблица 3

Коррелятивные зависимости ( r _xy ) между общим биохимическим составом икры и основными рыбоводными показателями

Вид	Биохимические показатели	Рыбоводные показатели
		Процент оплодотворения	Процент нормально развивающихся эмбрионов	Процент выхода	Длина пред-личинок на выклеве
Сазан	Вода	-0,027	-0,095	-0,121	+0,089
	Сухое вещество	+0,027	+0,095	+0,121	-0,089
	Белок	+0,104	+0,243	+0,224	+0,148
	Жир	+0,161	-0,041	-0,132	+0,139
	Мин. остаток	-0,141	-0,198	-0,152	-0,243
	«белок / жир»	-0,095	+0,113	+0,152	-0,074
Белый амур	Вода	-0,179	-0,107	-0,085	-0,281
	Сухое вещество	+0,179	+0,107	+0,085	+0,281
	Белок	+0,516	+0,461	+0,468	+0,490
	Жир	+0,150	+0,171	+0,140	+0,164
	Мин. остаток	-0,238	-0,265	-0,257	-0,142
	«белок / жир»	+0,161	+0,118	+0,143	+0,127
Пестрый толстолобик	Вода	-0,362	-0,236	-0,247	-0,294
	Сухое вещество	+0,362	+0,236	+0,247	+0,294
	Белок	+0,382	+0,370	+0,381	+0,309
	Жир	-0,042	+0,213	+0,219	+0,059
	Мин. остаток	+0,048	-0,144	-0,117	+0,105
	«белок / жир»	+0,182	-0,088	-0,119	+0,015

Примечание . В корреляционной таблице выделены достоверные коэффициенты корреляции при n = 3 5 + 41 Р 0 05 > 0,3 3, Р ₀₀₁> 0,42. Все расчеты проведены по сырой массе.

личества свободных жирных кислот в перезрелой икре, образующихся при распаде липопротеиновых комплексов (помимо гидролиза фосфоглицеридов).

Среди трех изученных нами видов лишь у белого амура выявлены положительные корреляции содержания b-липопротеидов с плотностью овулировавших икринок (rxy = +0,434 при P < 0,01) и средним диаметром набухшей икры (rxy = +0,504 при P < 0,01). С концентрацией b-липопротеидов в овулировавшей икре белого амура достоверно коррелируют и основные показатели развивающейся икры (см. табл. 4), что дает основания рассматривать этот параметр как один из критериев качества икры у данного вида. Прямо противоположная тенденция наблюдается для диаметра овулировавшей икры (P < 0,01).

у=(-0,5347557)*х*х+(28,14957)*х+(-283,1 863)

белок, % сырой массы

Рис. 1. Зависимость оплодотворяемости от количества белка в овулировавшей икре белого амура (R = 0,53 при P < 0,01)

белок, % сырой массы

Рис. 2. Зависимость процента выхода предличинок от содержания белка в овулировавшей икре белого амура (R = 0,51 при P < 0,01)

Рис. 3. Зависимость длины вылупляющихся предличинок от содержания белка в овулировавшей икре белого амура (R = 0,47 при P < 0,01)

Ни у одного из трех изученных видов не удалось выявить достоверных взаимосвязей количества b -липопротеидов в овулировавшей икре с размерно-весовыми характеристиками самок, их рабочей плодовитостью и упитанностью (табл. 4).

Поскольку важнейшей функцией липопротеидов является обеспечение избирательной проницаемости для клетки и ее органоидов [6], то уровень и динамику b-липопроте-идов в разнокачественной икре следует признать важной видовой особенностью белого амура, связанной, вероятно, со структурой мембран овулировавших яйцеклеток и развивающихся эмбрионов. Для трех изученных нами видов снижение уровня b-липопротеидов в икре (менее 250 мг % у сазана, 60 мг % у белого амура и 80 мг % у пестрого толстолобика) может служить биохимическим признаком постовулярного перезревания икры и полной потери оплодотворяемости.

Использование различных методов управления биопродукционным потенциалом размножающихся рыб, их физиологическим

Рис. 4. b -липопротеиды в разнокачественной икре карповых рыб

Таблица 4

Корреляции ( r _xy ) содержания b -липопротеидов в овулировавшей икре с биологическими характеристиками самок и развивающейся икры

Биологические характеристики	Сазан	Белый амур	Пестрый толстолобик
Возраст самок	-0,054	+0,172	+0,095
Масса самок	-0,272	+0,259	-0,013
Длина ( l ) самок	-0,247	+0,067	-0,015
Высота тела самок	-0,021	+0,312	-0,284
Индивидуальная рабочая плодовитость	-0,311	+0,205	-0,121
Упитанность самок	+0,074	+0,256	-0,027
Средняя масса овулировавших икринок	-0,023	-0,272	+0,213
Средний диаметр овулировавших икринок	+0,099	-0,469	+0,093
Плотность овулировавших икринок	-0,145	+0,434	-0,011
Средний диаметр набухшей икры	-0,173	+0,504	-0,053
Процент оплодотворения	-0,166	+0,331	-0,096
Процент нормально развивающихся эмбрионов	-0,003	+0,450	+0,005
Процент выхода предличинок	-0,011	+0,382	+0,002
Длина вылупляющихся предличинок	-0,004	+0,450	-0,062
n	35	38	41

Примечание. В корреляционных таблицах выделены достоверные коэффициенты корреляции при n =

³⁵ * ^{41 Р} 0,05 > ^0,33; ^Р 0,01 >^0,42.

состоянием, качеством получаемых половых продуктов, ходом эмбрионального развития и выживаемостью личинок, несомненно, скажется на рыбоводных результатах выращивания и продуктивности водных экосистем в условиях аквакультуры. Наиболее важным является улучшение качественных характеристик (размеров и выживаемости) личинок к моменту перехода на активное питание – именно в этот период определяется возможность существования и дальнейшего развития при неблагоприятных факторах внешней среды.

На одомашненной форме сазана – зеркальном карпе – можно показать практически линейную зависимость между содержанием белка в овулировавшей икре и характеристиками личинок – их длиной и выживаемостью не питавшихся особей L100 (рис. 5–6).

Логичным путем увеличения содержания этих компонентов в икре является подкормка производителей в преднерестовый период смесями с повышенным содержанием протеина и углеводов. Именно такие предложения вносились учеными-рыбоводами Г.М. Прониным [8] и Н.И. Масловой [7], хотя они не анализировали выживаемость личинок, а исходили только из результатов инкубации или продуктивности сеголетков карпа.

Аналогичные зависимости между выживаемостью не питающихся личинок и содержанием в икре белка выявлены и для растительноядных рыб – белого амура и пестрого толстолобика (см.: [3]). Отсюда вытекает необходимость создания микрокапсулированных плавающих кормов с повышенным содержанием протеина для этих видов.

Таким образом, среди изученных составляющих биохимического состава только для белковых компонентов овулировавшей икры удается выявить корреляции и регрессионные зависимости с характеристиками эмбрионального развития и выживаемостью не питавшихся личинок.

белок, % сырой массы

Рис. 5. Зависимость длины вылупляющихся предличинок от содержания белка в овулировавшей икре зеркального карпа (R = 0,48 при P < 0,01)

Рис. 6. Зависимость выживаемости L ₁₀₀ (ось У – мм) от содержания белка в овулировавшей икре зеркального карпа (ось Х – часы)