Значение гормонов репродукции в регуляции NK-клеток

Беременность представляет собой феномен по-л}ғаллогенной трансплантации, поскольку' плод на-половинуг генетически чужероден по отношению к матери. При беременности происходит формирование новых эндокринных взаимодействий, обеспечивающих нормальное сосуществование организмов матери и плода.

Известно, что гормоны могут детерм инировать функциональною активность клеток имшнной системы [Ширшев, 2014]. Наиболее физиологически значимыми, с угон точки прения, являются гормоны, появляющиеся в организме женщины только во время беременности. - хорионический гонадотропин (ХГ) и эстриол (Ез). Помимо этого, имкгунорегуляторную функцию осуществляют пептидные гормоны, уровень которых существенно повышается во время беременности，珀 счет плацентарного синтез? ■ лептин, грелин и кисспептин. Эти гормоны не только играют важную роль в ре-гуляции процессов репродукции [Hardie et ah 1997; Fuglsang et al.. 2 005; Horikoshi et aL. 2 003] но и способны оказывать существенное влияние на функциональную активность клеток иммунной сисгедіы [Ширшев, 2014].

Гестационный процесс затрагивает многие системы организма, в том числе и иммунную, что сопровождается изменениями б функциональной активности различных популяций лейкоцитов, направленных на сохранение плода. Естественные

电 Ширшев С. В._; Некрасова И. В., Горбунова О. Л., Орлова Е. Г., Масленникова И. Л., 2015

киллерные (NK) клетки представляют собой популяцию лимфоцитов врожденного нхшунитета, способных к проявлению цитотоксической, а также регуляторной активности. NK-клетки доминируют среди лимфоидных клеток, локализованных в децидуальной оболочке во время беременности. Они продуцируют цитокины, хемокины. ферменты, факторы роста сосуд 。屏 тем самым способствуя формированию и моделированию спиральных ар-терий. плацентации и рефляции инвазии трофобласта [Koopman et al. _r2OO3]_t Фетотрофические функции NK-клетик проявляются под воздействием специфических регуляторных сигналов, к которым, в первую очередь, можно отнести гормоны фетоплацентарного комплекса*

Цель работы - оценка елияния XT* Е% лептинак грел ина и кисспептина на экспрессию фенотипических маркеров сепарированным и NK-клетками. а также продукцию ими цитокинов.

Материалы и методы

В работе использована периферическая венозная крОЕь тдоровых небеременны* женщин репродуктивного возраста (п=10). из которой в градиен* те плотности фиколл-верографина (1.077 г/мл) выделяли мононуклеарные клетки. После этого получали обогащенную суспензию NK-клегок с использованием набора Dynabeads Untouched Human NK Cells («Invitrogcn». США). Чистота выделения, оцениваемая по экспрессии маркера NK-клеток NKp46 (Anti-liuman CD335.C5, «Beckman Coulter». США), составила 90-95%. Для поддержания жизнеспособности сепарированных NK-клеток во все пробы добавляли цитокины («GIBCO», США): интерлейкин (IL)-2 - 1 нг/мл, IL-12 - 2 нг/мл, IL-15 - 10 нг/мл [Vitale et aL 2002].

Гормоны использовали в физиологических концентрациях, соответствующих I и III триместрам беременности, соответственно: XT («Profasi»K Италия) - 100 МЕ/мл и 10 МЕ/мл [Cole, 2012], Е₃ («Biomedicals Inc»_? Германия) - 2 и 20 нг/мл ]&£€+ Reyniak. 1985]_h лептин («Sigma». США) - 10 и 35 нг/мл [Hardie et aL, 1997]. грелнн (哲 Sigma 巩 Израиль) - 1.25 и 0 X3 нг/мл [Fuglsang et aL, 2005J. кисспептин (Кисспептин-54. Me 休 tin. Synthetic. «Calbiochem», США) - 4.6 пМ/л и 9.6 пМ/л [Horikoshi et 』 L, 2003].

NK-клетки культивировали в объеме 500 мкл в полной питательной среде на основе среды RPMI-1640 с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США). 10 мМ Hcpcs («ICN Pharmaceuticals, Inc.»? США), 2 мМ L-гл^тамина («ICN Pliannaceuticals, Inc.», США) и 100 мкг/мл гентамицина («KRKA»? Словения) в прнсутствни цитокинов и гормонов в течение 3 сут,, после чего отбирали супернатанты и оценивали фенотип клеток в лимфоцитаpwoftf гейте на про точном цитометре («Becton Dickinson», США). Окрашивание клеток осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («Beckman Coulter», США)+ При учстс результатов подсчитывали нс мснсс 100 000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции л им фоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.

На выделенных NK-клетках оценивали экспрессию ингибиторной молекулы NKG2A (Anti-һшііап CD 159-РЕ), L-селектина (Anti-human CD62L-FITC), а также плотность экспрессии маркера CD56 (Anti-human CD56-PE).

Поскольку' выборочное распределение, оцениваемое по критерию Фишера, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали согласно парному г-критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Известно, что низкая экспрессия моле^лы CD56 (CD56^aim) служит маркером высокой цитотоксичности NK-клеток уровень которых снижается во время беременности [Saito el at. 2008]. При этом повышенное содержание CD16⁺56^dm NK-клсток в периферической крови у женщин ассоциировано С привычным невынашиванием беременности [Михнина, 2009]. Напротив. NK-клетки с высокой степенью экспрессии CD56 (CD56^br,gtlt) обладают низкой цитотоксичностью и выполняют регу.тяторные функции 亿 hang et at, 2006 ； Saito et al.. 20()8], и именно эти клетки инфильтрируют децидуальную обсиюнку во время беременности [Trundley, Moffett. 2004].

При оценке уровня экспрессии CD56 дюлекул на поверхности NK-клеток установлено, что кисспептин в концентрации, соответствующей I триместру беременности, достоверно увеличивает долю CD 56 也曲 клеток относительно контроля. Ез вне зависимости от концентрации обладает аналогичным действием, параллельно снижая уровень CD56^duiL клеток. ХГ, лептин и грелин не оказали влияния на изменение экспрессии маркера CD56 (табл. 1).

Важным показателем функциональной активности NK-клеток является наличие на их поверхности ингибиторных рецепторов* Известно, что экспрессия таких рецепторов, особенно NKG2A, периферическим и NK-клетками повышается б первые недели беременности, достигая максимума к третьем; месяцу гестации [Dosiou. Giudicc* 2005] Культивирование исследуемых гормонов с сепарированным и NK-клетками приводит к вида- мому поБышению процента NK-клеток, несущих ингибиторную молекулу NKG2A. однако статистически значимым действием обладают только ХГ б концентрации, соответствующей III триместру беременности. и Ед вне зависимости от концентрации (табл. 2). Большинство гормонов, за исключением грелнна, а также лептина и ХГ в низких концентрациях, стимулирует экспрессию L-селектина на CD 56b'@к NK-клеткаХғ а Ез в высокой концентрации； кроме того, угнетает экспрессию данного маркера на CD56dlm 冋^^鹏犬 Рядом авторов высказывается предположение о существовании субгю* пуляции регуляторных NK-клеток. характеризую щейся повышенной экспрессией CD56, L-cejieKTHHat NKG2A. а также некоторых маркеров Т-рег^ ляторных клеток [Zhang et al.? 2006； Saito et aL 2008]. Следовательно, во время беременности ХГ (концентрацияк характерная для I триместра). Е§ и кисспептин могут индуцировать регуляторный фенотип NK-клеток. одновременно снижая их цитотоксический потенциал. Кроме того, достоверное увеличение CD 5 6"嗯"CD62L1 клеток под влиянием ХГ, Em и кисспептина говорит об их способности усиливать миграцию данных NK-клеток в плаценту при физиологически протекающей беременности [Moflett-King, 2002].

Таблица 1

Влияние гормонов на сгенень экспрессии молекул CD56 NK-клеіками (М±ш)

Экспериментальное БоздейстБие	11	NKp46+CD56bnght (%)	NKp46+CD56dim (%)
Контроль	7	33 22±L441	68.07±2.68S
Лептин (10 нг/мл)	7	3O.35± 1.665	72.25±5.873
Лептин (35 нг/мл)	7	29.5Ы 558	75Л4±8.704
Г релин (1.2 нг/мл)	7	31.42±2,654	70.26±7.387
Г релин (0.8 нг/мл)	7	32.15±2.496	71.56±5,685
Кисспептин (4.6 пМ/л)	7	37.12=Ы.262 р(б-1)<0,05	60.30±7.365
Кисспептин (9*6 пМ/л)	7	33.51iO.652	67.84±6 70 3
ХГ (100 МЕ/мл)	7	33.50±2,288	66 39±4+326
ХГ (10 МЕ/мл)	7	35 31±2 」 34	66 3 6±4.5 88
ЕЗ (2 нг/мл)	7	40.60±2^38 р(10-1)<0,05	57.80±4+260 р(10-1)<0,05
ЕЗ (20 нг/мл)	7	39.20 士 3.558 1 ) (11-1)<0.05	57.8U4J45 р(11-1)<0.05

Таблиші 2

Влияние гормонов на эксп] ) ессию NKG2A и Ъч:електина (CD62L) NK-клетками (М±т)

Экспериментальное воздействие	и	NKp46+NKG2A+ %	CD56brightCD62L+ %	CD56dnnCD62L+ %
Контроль	7	2167 士 L312	8.3U1.778	27.01i4,631
Лептин (10 нг/мл)	7	21.55іЗД76	9,58±2.806	2 9 8 5і4.968
Лептин (35 нг/мл)	7	21.48±2+666	12+47±2.905 р(3-1)<0.05	32.63±5,303
Грелин (1.2 нг/мл)	7	22.36±3,984	10.48±2.079	30.75±5,078
Г релин (0.8 нг/мл)	7	24.10±4.760	11.28±2.235	32.34±6 」 33
Кисспептин (4.6 пМ/л)	7	27.73±4,399	12,09 土 1.673 р(6-1)<0.05	26.32±4.726
Кисспептин (9 6 пМ/л)	7	28.47±4+938	13+59±2 911 р(7-1)<0.05	32 40±6430
ХГ (100 МЕ/мл)	7	2H.SS±3T697	1LS4±2.496 р(8-1)<0.05	3L57±4.261
ХГ (10 МЕ/мл)	7	29.12±3.360 р(9-1)<0.05	12.51±4.419	24.8U2.750
ЕЗ (2 нг/мл)	7	ЗО.57±ЗД98 р(10-1)<0+05	12.S7±2.221 р(10-1)<0+05	25.61i4.675
ЕЗ (20 нг/мл)	7	29 60±3 」 86 р(И-1)<(),05	20+96±5.306 卩 ( 11/)415	21.8U2.577 р(11-1)<0,05

Таким образом, в I триместре беременности Е? и кисспептин повышают процент CD5卢飢 NK-клеток и одновременно усиливают экспрессию на них L-селектина. ХГ? не влияя на уровень CD 56b 母' повышает только экспрессию L-селектина В отличие от кисспептина и Х「. Е? до полнительно достоверно снижает количество CD5卢клеток и стимулирует экспрессию ингибиторной молекулы NKG2A, В ІП триместре высокий уровень СD5辞由(?D62L клеток поддерживается всеми исследуемыми гормонами.災i исключением грелина. При этом Ej тормозит формирование

856dm лнмфоцитиЕ, в том числе несупшк L-селектин, но так же как и ХГ, стимулирует экспрессию NKG2A.

Известно, что CD 56bd^ NK-клетки способны продуцировать значительные количества различных цитокинов, что посл>гжило основанием выделения различных субтипов периферических и децидуальных NK-клеток. Так. NK1 продуцируют IFN-gamma и TNF-alpha, NK2 - IL-4, IL& 匸仇 IL-B; NK3 - TGF-beU, NKrl - IL-10 [Higiima-Myojo et al., 200 5; Saito et al., 2007, 2008]t Установлено. что в периферической крови небеременных женщин преобладают NK1-клетки. В период беременности повышается количество NKrl клеток. а децидуальные NK-клетки представлены в основном TGF-Ье1а-прод>' цир)ющими NK3 лимфоцитами. При этом TGF-bela но только оказывает им щъосупрессорное действие на многие популяции лимфоцитов, но и способствует ангиогенезу [Ferrari et al.. 2009} определяя иммунотрофиче-ское действие.

При оценке гормонального контроля за уровнем регуляторннх цитокинов NK-клеток установлено. что в супернатантах периферических NK-клеток преобладает IFN-gamma (NKl)t При этом кисспептин. ХГ и Е丸 вне зависимости от концентрации, достоверно угнетают его продукцию и параллельно в концентрациях, соответствующих III триместру беременности, усиливают секрецию противОБОСпалительного цитокина TGF-bela. Продукция цитокинов IL-4 и IL-10 изначально была на низком уровне и угнеталась под влиянием нссле-дуемых гормонов (табл* 3).

Таблица 3

Влияние гормонов на продукцию цитокинов NK-клетками* пг/мл (М±ш)

Экспериментальное воздействие	п	IL-4	IL-10	TGF-beta	IFN-gamma
Контроль	9	%69±0 」 88	25.62±1.247	263.08±7+843	506+45±26.403
Лептин (10 нг/мл)	9	7 5 7±0 984	24.96±1.698	270.49±20,3 74	520Д5±45.285
Лептин (35 нг/мл)	9	7 63±0+306 р(3-1)<0.05	23.61±0.973 р(3-1)<0+05	2 7 5 319.999	555+91±36.43 8
Грелин (1.2 нг/мл)	9	8£7±0+897	23.89±1.945	271.98±1О,385	450+36±45.695
Г релин (0.8 нг/мл)	9	%26±0579	22.04±1.328 р(5-1)<0.05	267.50±8.001	439.89±55.319
Кисспептин (4.6 пМ/л)	9	7.46±0449 р(6-1)<0.05	22 97±1О56 р(6-1)<0.05	2 47 26±18 622	345£2±34 631 р(б-1)<0.05
Кисспептин (9.6 пМ/л)	9	7 72±0 370 р(7-1)<0.05	22.24± 1.049 р(7-1)<0.05	27Х.89± 12.457 р(7-])<0.05	366.27±42.3 25 р(7-1)<0.05
ХГ (100 МЕ/мл)	9	7.92±0.762	24.59±1754	277.07=Ы3.010	3 72.06=ь48.0 3 7 р(8-1)<0.05
ХГ (10 МЕ/мл)	9	7.06=Ь0.489 р(9-1)<0.05	21.81=Ы.431 р(9-1)<0.05	282.38=Ы2.196 р(9-1)<0.05	3 44,68±43.7 3 2 р(9-1)<0.05
ЕЗ (2 нг/мл)	9	7.00±0.323 р(10-1)<0.05	21.08±1.358 р(10-1)<0.05	2 84.9 8il0.882	3 21.25±38.747 р(10-1)<0.05
ЕЗ (20 нг/мл)	9	7.28±0,218 р(11-1)<0.05	21.5Ы.590 р(11-1)<0.05	287.53±5 」 65 р(11-1)<0.05	374.3S±52.381 р(11-1)<0.05

Таким образом, в I триместре беременности кисспептин и Е5 снижают продукцию IL-4, IL-10 и IFN-gainma? а ХГ только секрецию IFN-gamma сепарированными ККтсіеткамн, В III триместре практически все исследуемые гормоны способствуют снижению концентрации IL-4 и IL-10, которые в поздний период беременности не играют значимой роли. При этом Е+ ХГ и кисспептин, стнмулнр〉ют продукцию TGF=beia, угнетая секрецию IFN-gamma. По-видимом>; гормоны репро-думшн выспгпают факторами, определяющими дифференцировку' NK1 клеток в NK3 лимфоциты. Учитывая, что TGF-beta является одним из факторов, способствующих трансформации периферических NK-клеток в децид>?альные [Cerdeira et al., 2013]. роль гормонов как факторов нндукцнн де цидуальных NK-клеток существенно возрастает. В заключение необходимо отметить, что, во время беременности, репродуктивные гормоны могугт выступать в качестве физиологических регуляторов фенотипа и уровня секреции отдельных цитокинов, характерных для реп'ляторной NK3 субпогп^ляции.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13 -04-9603 5-р_урал_а.