Значение преаналитической стадии исследования десневой жидкости

Общепризнанный этиологический фактор развития воспалительных заболеваний пародонта, микробная биопленка, вовлекает в патогенетический круг иммунные механизмы защиты. Нарушение баланса между бактериальной инвазией и иммунных защитных систем ротовой полости считается ведущей причиной развития деструкции тканей пародонта [1, 2]. Компоненты клеточных стенок анаэробных пародонтопатогенов взаимодействуя с паттерн-распознающими рецепторами TLR-4 активируют выброс провоспалительных цитокинов, запускающих комплекс защитных механизмов врожденного и приобретенного локального иммунного ответа. Активированные микробными продуктами нейтрофилы вызывают одновре- менно вместе с разрушением микробных агентов деструкцию пародонтальных тканей [2, 3]. При их нарастании и увеличении глубины пародонтальных каналов происходит разрушение опорных структур зубов, то есть тканей десны, пародонта и альвеолярной кости. Одним из достоверных источников в исследованиях воспалительных процессов при заболеваниях пародонта считается десневая жидкость [4, 5].

Десневая жидкость относится к биологическим жидкостям, при участии которых в слюну поступают слущенные эпителиальные клетки, лейкоциты (95–97 % нейтрофилов, 1–2 % лимфоцитов, 2–3 % моноцитов), микроорганизмы, белки, ферменты. Также в ней содержится микрофлора – стрептококки, стафилококки, фузобатерии, спирохеты, простейшие.

В десневой жидкости, контактирующей со средой, в которой происходят метаболические и патологические процессы в тканях пародонта, содержится высокая концентрация растворимых биологически активных медиаторов клеток, цитокинов, вовлеченных в иммунный ответ. При воспалительных заболеваниях пародонта их секреция происходит в «ворота» инфекции или в десневую жидкость [4, 5, 6]. Цитокины секретируются в основном лимфоцитами, моноцитами и макрофагами, но взаимодействуют с огромным числом клеток, связываясь со специфическими мембранными рецепторами. Это вызывает снижение или увеличение экспрессии мембранных протеинов, рост клеток, пролиферацию, изменение дифференцировки и секреции эффекторных молекул. IL-1 и TNF-α относят к провоспалительным цитокинам из-за их вездесущности, раннего и интенсивного ответа на инвазирующие агенты (бактерии или токсины). Повышенная экспрессия IL-1β запускает развитие воспалительного ответа и стимулирует выделение других провоспалительных цитокинов. Продукция провоспалитель-ных цитокинов и хемокинов (IL-1β, IL-6, IL-8) при пародонтитах включением в регуляцию иммунного ответа эпителиальных клеток [5, 6, 7].

В качестве основного метода определения концентрации цитокинов в десневой жидкости в большинстве исследований последних лет использован твердофазный иммунофер-ментный анализ. Вместе с тем результаты исследования имеют значительные различия. Это прежде всего связано с различиями метода забора, последующего хранения до начала исследования проб десневой жидкости.

Цель исследования: установить значение преаналитического этапа получения и хранения десневой жидкости при обследовании пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта.

Материалы и методы. Обследовано 20 женщин, в возрасте от 40 до 55 лет, в том числе: 10 – хроническим пародонтитом легкой степени тяжести (ХП) и адентией; 10 практически здоровых пациентов с адентией и без патологических изменений тканей пародонта. Критерии включения: старше 40 лет, с дефектами зубного ряда, возникшими на разных сроках после удаления зубов, подписавшие протокол информированного согласия о цели и характере работы.

Критерии исключения: моложе 40 лет, с нарушениями коагуляции и гемостаза, заболеваниями иммунной системы, хроническими инфекционными, психическими, онкологическими заболеваниями (туберкулез, актиномикоз), с ВИЧ инфекцией, женщины в период беременности и лактации, при отказе больного от обследования.

Для оценки влияния преаналитического этапа забора десневой жидкости на концентрацию определяемых цитокинов десневой жидкости у 10 практически здоровых лиц и 10 пациентов с ХП десневую жидкость собирали одновременно двукратно.

Метод сбора десневой жидкости. После очищения зубов и прилегающих к ним десны от зубного налета, их изолировали от слюны ватными валиками и высушивали. Забор материала из десневой борозды проводили с помощью специальных мишеней в виде бумажных, абсорбирующих, стерильных эндодонтических штифтов (Absorbent Paper Points, № 25), которые применяются в терапевтической стоматологии для высушивания корневого канала перед пломбированием. Штифты стерильны, изготовлены из бумаги высокой абсорбирующей способности, не содержащей примесей связующих веществ, идеальной плотности для введения в десневую борозду. При аналитическом взвешивании 30 бумажных пинов, введенных в десневые пародонтальные карманы и выдержанных до полного пропитывания, установлено, что среднее количество сорбируемой ими десневой жидкости составляет 5,0 ± 0,05 мг. С помощью пинцета и стоматологической гладилки последовательно 2 штифта погружают в десневую борозду. Каждый из них в течение 100–120 с полностью пропитывается десневой жидкостью и переносился в две пробирки типа Eppendorff. В одной из них содержалось 1000 мкл 0,155М раствора хлорида натрия. В другой 0,2 % биоцида ProClin серии 300 [8]. В результате получали образцы десневой жидкости с разведением 1:200, которые замораживали при –40 °С и хранили до проведения анализа.

Концентрацию цитокинов IL-1β, IL-8, МСР-1, VEGF, IL-1RA в образцах десневой жидкости определяли методом иммуноферментного анализа с помощью соответствующих наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Для статистической обработки результатов исследований использовали набор программ «Statistica v6.0». При сравнении результатов использовали непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни в программе Multi ExperimentViewer (Р < 0,05).

Результаты и их обсуждение . Полученные результаты представлены с табл. 1.

Результаты исследования (табл. 1) показали, что состав десневой жидкости у лиц без патологии пародонта и с ХП имеет значительные различия, основой которого является высокое содержание таких провоспалительных цитокинов, как IL-1β (в 5,0, Р < 0,05 ), IL-6 (в 23,8, Р < 0,05), IL-8 (в 4,2 , Р < 0,05), МСР-1 (в 1,9, Р < 0,05), TNFα (в 1,5). Подъем их концентрации обусловлен вовлечением в воспалительный процесс одновременно всех клеток иммунной защиты десневой борозды (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты, эпителиоциты).

Представленные различия степени нарастания содержания основной группы провоспа-лительных цитокинов в десневой жидкости у больных ХП получены при использовании среды для экстракции десневой жидкости с ProClin 300. Содержание цитокинов было значительно выше в десневой жидкости, экстрагированной 0,155М раствором хлорида натрия вместе с 0,2 % ProClin 300. В меньшей степени данная среда оказывала влияние на уровень основных провоспалительных цитокинов десневой жидкости практически здоровых лиц. Значимое сохранение концентрации в ней отмечено для: IL-8 – в 1,49 (Р < 0, 05); МСР-1 – в 1,67 (Р < 0,05); TNFα – в 2,3 (Р < 0,05). У пациентов ХП в среде, содержащей ProClin 300, был сохранен подъем всей основной группы провоспалительных медиаторов. Подъем уровня медиаторов в десневой жидкости составил: IL-1β – в 1,95 (Р < 0,05); IL-6 – в 2,13 (Р < 0,05); IL-8 – в 2,23 (Р < 0,05); МСР-1 – в 2,35 (Р < 0,05) ; TNFα – в 2,98 (Р < 0,05). То есть использование среды с антимикробной активностью для экстракции десневой жидкости сразу после её забора бумажным штифтом позволяет обеспечить стабильность определения истиной концентрации основной группы цитокинов. Преимуществом такого биоцида, как ProClin является блокада разрушения содержащихся в отделяемом десневом канале разнообразных форм микроорганизмов. Их наличие в получаемой для исследования десневой жидкости как при интактном пародонте и особенно при пародонтитах приводит к быстрому разрушению практически всей определяемой в настоящее время с помощью иммуноферментного анализа группы цитокинов.

Влияние состава разводящего раствора при взятии десневой жидкости на содержание основных про-и противоспалительных цитокинов

Таблица 1

Примечание: * - Р < 0,05 при сравнении результатов исследования десневой жидкости, перенесенных в пробирки с 0,155М раствором хлорида натрия и 0,2 % раствором ProClin 300 и без него; ** – Р < 0,05 при сравнении результатов исследования десневой жидкости у лиц с адентией и без патологических изменений пародонта и у больных с адентией и пародонтитом легкой степени.

Заключение. Таким образом, при определении концентрации цитокинов в зубодесневой жидкости важнейшее значение для получения достоверных и воспроизводимых результатов анализа имеет преаналитический этап. Введение в раствор для экстракции и последующего хранения десневой жидкости «ProClin 300» может быть использовано для повышения чувствительности и специфичности всей группы исследованных цитокинов в диагностике воспалительных заболеваний пародонта. Внедрение исследования биомаркеров десневой жидкости для оценки воспалительных заболеваний пародонта является перспективным направлением внедрения современных систем принятия решений в практической стоматологии.