Значимость свободнорадикальных процессов в деградации коллагеновых фибрилл при экспериментальном пародонтите

Введение. Хронический пародонтит представляет собой патологию пародонта, поражающую до 90 % населения планеты, являющуюся одной из основных причин потери зубов и тем самым приобретающую высокую социальную значимость [1].

Поражение пародонта опосредовано колонизацией микроорганизмов, обладающих высоким пародонтопатогенным потенциалом и цитотоксическим действием за счет выработки большого количества ферментов и их метаболитов [2–5]. Продукция токсинов ведет к активации тканевых макрофагов с повышенной выработкой провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, TNF-α), обладающих хемотаксическим действием в отноше- нии нейтрофилов, дегрануляция которых способствует высвобождению матриксных металлопротеиназ, гидролизирующих молекулы коллагена, что приводит к его разрушению [6–8]. Активация иммунокомпетентных клеток способствует гиперпродукции активных форм кислорода (АФК), оказывающих прямое деструктивное действие на клеточные структуры пародонта и инициирующих свободнорадикальное окисление липидов [9]. Недостаточный антиоксидантный потенциал клеток, проявляющийся невозможностью нейтрализации повышенной выработки АФК, приводит к развитию оксидативного стресса, сопровождающегося утратой клетками регуляторных функций, формированием вторичных деструктивных процессов [10–13]. Хронизация воспаления ведет к неуклонно прогрессирующему разрушению соединительнотканного каркаса пародонта, что приводит к последующей потере зубов [14–18].

Исследование активности процессов свободнорадикального окисления, выявление их сопряженности с нарушениями обмена коллагена и последующей его деструкции представляют высокий интерес в связи с возможностью определения роли основных предикторов повреждения, что будет способствовать разработке новых способов диагностики и своевременного лечения пародонтита уже на ранних этапах его формирования, тем самым предупреждая развитие и поддержание хронического воспаления.

Цель исследования. Оценка активности свободнорадикальных процессов повреждения и выявление их сопряженности с нарушениями обмена коллагена в динамике заболевания на модели экспериментального пародонтита.

Материалы и методы. Экспериментальное исследование проведено на 60 белых беспородных крысах обоего пола массой 200–250 г, содержащихся в стандартных лабораторных условиях учебного вивария Национального исследовательского Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева. Эксперимент проведен в соответствии с международными этическими нормами, изложенными в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург,

• 1986). Исследование одобрено локальным этическим комитетом Медицинского института Национального исследовательского Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева.

Животные были разделены на 2 серии. Первую серию составили интактные животные в количестве 30 особей. Вторая серия (30 крыс) использовалась для воспроизведения модели экспериментального пародонтита, предложенной К.Д. Школьной, В.Г. Атрушке-вич. Животным трехкратно (на 1, 3 и 5-е сут) внутримышечно вводили преднизолон в дозе 12 мг/кг массы тела. На 5-е сут с момента последнего введения преднизолона животным под общим наркозом (золетил 0,03 мл внутримышечно) фиксировали лигатуру путем прошивания межзубного сосочка между первым и вторым молярами верхней челюсти слева, закрепляя узел с вестибулярной стороны пломбировочным материалом на фоне приема мягкого корма [19]. Активность процессов свободнорадикального окисления липидов оценивали по показателям продуктов пероксидации: малонового диальдегида (МДА) при спонтанном и железоиндуцированном (Fe-МДА) окислении, диеновых конъюгатов (ДК). Активность антиоксидантного потенциала определяли по уровню основных ферментов крови – каталазы и супероксиддисмутазы (СОД).

Общую активность свободнорадикального окисления оценивали по параметрам биохемилюминесценции, полученным с использованием флюориметра-хемилюмино-метра «Флюорат – 02 – АБЛФ-Т» (Россия): максимальной интенсивности свечения (I max ), светосуммы хемилюминесценции (S).

Оценку метаболизма коллагена проводили с использованием методики П.Н. Шараева, направленной на определение концентрации свободного (СО), петидносвязанного (ПСО) и белковосвязанного (БСО) оксипролина [20].

Контроль результатов исследования проводили после снятия лигатуры на 3, 7 и 28-е сут. Вывод животных из эксперимента осуществляли на 28-е сут под общей анестезией путем декапитации. Статистический анализ результатов осуществляли с использованием профессионального программного пакета SPSS.

Результаты и обсуждение. На 3-и сут после снятия лигатуры отмечалось повышение концентрации ДК крови опытной группы в 2,5 раза (p<0,001) по сравнению с интактными показателями (табл. 1). Выявлялось увеличение уровня МДА плазмы и эритроцитов в 2,1 (p<0,001) и 1,9 раза (p<0,001) соответственно. Определялось повышение концентрации МДА при железоиндуцированном окислении в 2,3 раза (p<0,001) в плазме крови и в 1,9 раза (p<0,001) в эритроцитах. Данное повышение уровня первичных и вторичных метаболитов перекисного окисления липидов свидетельствует о резкой интенсификации свободнорадикальных механизмов повреждения на фоне альтеративного и экссудативного воспаления. Эти условия способствуют угнетению антиоксидантного потенциала клеток, активации распада и торможения ресинтеза ферментов антиоксидантной системы, о чем свидетельствует снижение уровня каталазы плазмы крови и эритроцитов в 3,2 (p<0,001) и 2,0 раза (p<0,001) соответственно, а уровня СОД – в 3,1 раза (p<0,001) по сравнению с аналогичными показателями интактной группы (табл. 2).

Высокая интенсивность свободнорадикального окисления подтверждалась данными, полученными методом биохемилюми-несцентного анализа: отмечалось увеличение максимальной интенсивности свечения Imax в 2,2 раза относительно должных показателей (p<0,001) в сочетании с повышением значения светосуммы S на 90,7 % (p<0,001). Полученные данные говорят об истощении возможностей антиоксидантной системы и прогрессировании мембранодеструктивных процессов.

На 3-и сут отмечалось нарушение метаболизма коллагена с преобладанием и резкой активацией катаболических реакций, что говорит о развитии деструктивных процессов соединительнотканного каркаса пародонта. Это подтверждалось увеличением концентрации СО на 126,9 % (p<0,001) и ПСО на 91,5 % (p<0,001) в сочетании с уменьшением коэффициента ПСО/СО на 16,7 % (p<0,05). Показатель БСО, свидетельствующий об усилении синтеза коллагена, не имел достоверного изменения (p>0,05) (табл. 3).

На 7-е сут эксперимента наблюдалось повышение концентрации ДК на 146,7 % (p<0,001) по сравнению с показателями интактной группы. Уровень МДА плазмы при спонтанном окислении повысился на 102,4 % (p<0,001), при железоиндуцированном окислении – на 111,6 % (p<0,001) относительно данных интактной группы животных. Увеличение концентрации МДА эритроцитов при спонтанном окислении составило 78,4 % (p<0,001), при железоиндуцированном – 80,4 % (p<0,001) по сравнению с аналогичными показателями интактной группы. В ходе проведения сравнительного анализа концентраций продуктов свободнорадикального окисления на 3-и и 7-е сут в опытной группе статистически значимых отличий не выявлено (p 1 >0,05).

Отмечалось снижение уровня активности ферментов антиоксидантной системы: концентрации каталазы в плазме крови и эритроцитах – на 64,0 % (p<0,001) и 45,0 % (p<0,001) соответственно относительно данных интактной группы животных (табл. 2). Уровень СОД был снижен на 65,1 % (p<0,001). При сравнении с показателями 3-х сут определялось увеличение концентрации каталазы плазмы на 13,9 % (p 1 <0,05).

Сохранение высокой интенсивности свободнорадикальных процессов подтверждалось биохемилюминесцентным исследованием, в ходе которого было выявлено превышение нормативных значений показателями интенсивности свечения Imax на 109,5 % (p<0,001) и светосуммы S на 81,5 % (p<0,001).

На 7-е сут во второй серии содержание СО в плазме крови существенно не отличалось от аналогичного показателя 3-х сут эксперимента (p1>0,05), тем самым подтверждая продолжающуюся деструкцию коллагеновых струк-тур. На этом фоне отмечалось повышение концентрации ПСО на 262,9 % (p<0,001) и БСО на 55,3 % (p<0,001). Отношение ПСО/СО увеличилось до 0,89±0,14 (p<0,001), что на 64,9 % выше показателей интактной группы. Полученные данные свидетельствовали об активации анаболических реакций метаболизма коллагена в сочетании с сохраняющимся достаточно высоким уровнем деструктивных процессов, происходящих в пародонтальной ткани.

Таблица 1

Table 1

Динамика показателей свободнорадикальных процессов при экспериментальном пародонтите

Dynamics of free radical processes in experimental periodontitis

Показатель Parameter	Контрольная группа (n=30) Control group (n=30)	Опытная группа (n=30) Experimental group (n=30)
		3-и сут Day 3	7-е сут Day 7	28-е сут Day 28
ДК, ед/мл Diene conjugates, U/ml	0,15±0,05	0,38±0,06*	0,37±0,04*	0,34±0,05*
МДА плазмы, мкмоль/л Plasma MDA, µmol/l	4,93±0,28	10,11±0,77*	9,98±0,59*	9,11±0,51*
Fe-МДА плазмы, мкмоль/л Plasma Fe-MDA, µmol/l	9,58±0,32	21,72±1,72*	20,27±1,31*	19,76±1,36*
МДА эритроцитов, мкмоль/л Erythrocyte MDA, µmol/l	8,14±0,55	15,73±1,12*	14,52±0,88*	13,18±0,76*
Fe-МДА эритроцитов, мкмоль/л Erythrocyte Fe-МДА, µmol/l	17,49±1,42	32,39±1,53*	31,56±1,47*	30,32±1,15*

Примечание. * – достоверность различий с показателями интактной группы (р<0,001).

Note. * – the differences are significant compared with the intact group (р<0.001).

Таблица 2

Table 2

Динамика показателей антиоксидантной системы и биохемилюминограммы при экспериментальном пародонтите

Dynamics of the antioxidant system and biochemiluminogram in experimental periodontitis

Показатель Parameter	Контрольная группа (n=30) Control group (n=30)	Опытная группа (n=30) Experimental group (n=30)
		3-и сут Day 3	7-е сут Day 7	28-е сут Day 28
Каталаза плазмы, мккат/(с·л) Plasma catalase, µkat/L	1,14±0,05	0,36±0,03*	0,41±0,04 +	0,48±0,03 *
Каталаза эритроцитов, мккат/(с·л) Erythrocyte catalase, µkat/L	2,31±0,13	1,18±0,07*	1,27±0,09*	1,31±0,08*
СОД, ед. акт. SOD, units act.	1,29±0,05	0,42±0,04*	0,45±0,05*	0,51±0,06*
I max , mv/s I max , mv/sec	1,79±0,11	3,92±0,18*	3,75±0,18*	3,53±0,16*
S, mv/s S, mv/sec	27,52±0,76	52,49±3,37*	49,95±2,16*	47,93±2,21*

Примечание. * – достоверность различий с показателями интактной группы (р<0,001); ⁺ – достоверность различий с показателями серии на 3-и сут (р 1 <0,05); жирный шрифт – достоверность различий с показателями серии на 7-е сут эксперимента (р 2 <0,05).

Note. * – the differences are significant compared with the intact group (р<0.001); ⁺ – the differences are significant compared with the experimental group (Day 3) (р 1 <0.05); bold font – the differences are significant compated with the experimental group (Day 7) (р 2 <0.05).

На 28-е сут эксперимента обозначилась тенденция к ограничению увеличения уровней первичных и вторичных метаболитов свободнорадикального повреждения, но данные показатели по-прежнему превышали должные значения: уровень ДК – на 126,7 % (p<0,001), МДА плазмы и эритроцитов – на 84,8 % (p<0,001) и 61,9 % (p<0,001) соответственно. Концентрация МДА в условиях железоиндуцированного окисления превышала аналогичные показатели интактной серии на 106,3 % (p<0,001) в эритроцитах и на 73,4 % (p<0,001) в плазме крови.

Активность каталазы плазмы и эритроцитов к концу эксперимента незначительно возросла, но по-прежнему была ниже нормативных значений в 2,4 (p<0,001) и 1,8 (p<0,001) раза. Уровень супероксиддисмутазы был ниже, чем в интактной группе, в 2,5 (p<0,001) раза.

Сохранение высокого уровня активности свободнорадикального окисления и невоз- можность его нейтрализации эндогенной антиоксидантной системой подтверждались данными, полученными в ходе проведения биохемилюминесцентного анализа: показатель максимальной интенсивности свечения Imax превышал нормальное значение на 97,2 % (p<0,001), величина светосуммы S – на 74,2 % (p<0,001).

К завершению эксперимента (на 28-е сут) отмечалось снижение концентрации СО, но она по-прежнему превышала значения у интактных животных в 2,1 раза (p<0,001). Отмечался дальнейший рост уровней БСО и ПСО в 2,1 (p<0,001) и в 5,3 раза (p<0,001) соответственно. Наблюдалось повышение коэффициента ПСО/СО на 241,4 % относительно показателей интактной серии. Это указывало на активацию процессов фибриллогенеза в области патологических грануляций, образовавшихся в десневых карманах, и формирование фиброзной дегенерации пародонтальных тканей.

Таблица 3

Table 3

Динамика показателей метаболизма коллагена при экспериментальном пародонтите

Dynamics of collagen metabolism in experimental periodontitis

Показатель Parameter	Контрольная группа (n=30) Control group (n=30)	Опытная группа (n=30) Experimental group (n=30)
		3-и сут Day 3	7-е сут Day 7	28-е сут Day 28
СО, мкмоль/л Free oxyproline, µmol/l	13,78±0,48	31,26±0,85*	30,15±1,07*	28,58±0,88*
ПСО, мкмоль/л Peptide-bound oxyproline, µmol/l	7,38±0,37	14,13±0,71*	26,78±1,13*	39,13±1,37 *
БСО, мкмоль/л Protein-bound oxyproline, µmol/l	51,23±0,93	52,11±1,55	79,56±1,53*	105,23±2,44 *

Примечание. * – достоверность различий с показателями интактной группы (р<0,001); жирный шрифт – достоверность различий с показателями серии на 7-е сут эксперимента (р 2 <0,05).

Note. * – the differences are significant compared with the intact group (р<0.001); bold font – the differences are significant compared with the experimental group (Day 7) (р 2 <0.05).

Проведенный корреляционный анализ выявил сильную прямую связь показателей свободнорадикальных процессов окисления с маркерами метаболизма коллагена и обрат- ную корреляционную связь с антиоксидантным энзимным потенциалом (табл. 4), что указывало на сопряженность исследуемых патогенетических механизмов.

Таблица 4

Table 4

Корреляционная зависимость между показателями свободнорадикальных процессов и метаболизма коллагена при экспериментальном пародонтите

Correlation dependence between parameters of free radical processes and collagen metabolism in experimental periodontitis

Показатель Parameter	МДА плазмы, мкмоль/л Plasma MDA, µmol/l	Fe-МДА плазмы, мкмоль/л Plasma Fe-MDA, µmol/l	ДК, ед/мл Diene conjugates, U/ml	Каталаза плазмы, мккат/(с·л) Plasma catalase, µkat/(s×l)	СОД, ед. акт. SOD, units act.	I max, mv/s I max, mv/sec	S, mv/s S, mv/sec
	Корреляционный показатель Пирсона Pearson’s correlation index
СО, мкмоль/л Free oxyproline, µmol/l	0,95	0,93	-0,98	-0,78	-0,99	0,99	0,98
ПСО, мкмоль/л Peptide-bound oxyproline, µmol/l	0,92	0,97	-0,96	-0,84	0,98	-0,99	0,78
БСО, мкмоль/л Protein-bound oxyproline, µmol/l	0,91	0,97	-0,96	-0,81	0,98	-0,99	0,99

Заключение. Экспериментальное воспроизведение пародонтита сопровождалось возрастающей активацией воспалительных процессов и последующей деструкцией паро-донтальных структур, что способствовало активации биорадикальных процессов. Образующиеся в ходе этого процесса активные формы кислорода, взаимодействуя с компонентами мембран клеток, способствовали интенсификации процессов перекисного окисления липидов, что проявлялось многократным повышением первичных и вторичных метаболитов липопероксидации с сохранением данного уровня на протяжении всего эксперимента. Это сопровождалось повреждением и истощением антиоксидантной системы, о чем свидетельствовало угнетение каталазной и супероксиддисмутазной активности. В условиях гиперпродукции АФК нейтрофилами антиоксидантная система организма теряет способность нейтрализовать их повышенную выработку, что обосновывает необходимость включения в терапию препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами.

Проведенный корреляционный анализ выявил сильную зависимость между показате- лями липопероксидации и метаболизма коллагена, тем самым подтверждая сопряженность биорадикальных оксидативных процессов с деструктивными изменениями коллагеновых структур пародонта. В первые дни исследования отмечалось значительное повышение уровня СО, что свидетельствовало о преобладании катаболических процессов метаболизма коллагена. В последующем происходило увеличение уровней БСО, ПСО на фоне сохраняющихся высоких показателей СО. Это объясняется интенсификацией процессов фибриллогенеза, приводящих к разрастанию грануляционной ткани в области имеющихся десневых карманов, уже более подверженной действию лизосомальных ферментов в силу ее нестабильной структуры.

Таким образом, полученные данные обосновывают применение маркеров свободнорадикального окисления и метаболизма коллагена как диагностических критериев, позволяющих прогнозировать течение пародонтита и оценивать эффективность проводимого лечения, а также аргументируют необходимость включения в комплексную терапию препаратов антиоксидантного типа действия.