Адаптация растений-регенерантов пшеницы к условиям ex vitro: работа устьиц

Большинство биотехнологических методов культуры in vitro направлено на получение в конечном этапе полноценных фертильных растений-регенерантов. Основная проблема в этой области исследований – низкая выживаемость растений-регенерантов при переносе их из условий культуры in vitro, характеризующихся высокой влажностью воздуха и низкой освещенностью, в посткультуральные условия ex vitro , характеризующиеся пониженной влажностью воздуха и высокой освещенностью.

Разработка эффективной системы получения полноценных, с качественными семенами, растений-регенерантов остается актуальной и до настоящего времени. Несмотря на то, что накоплен значительный фактический материал, касающийся различных аспектов исследования выживаемости растений-регенерантов, многие вопросы остаются открытыми. Так, слабо изучена работа устьичного аппарата в процессе развития регенерантов in vitro и ex vitro и особенно в критический момент переноса регенерантов из условий in vitro в условия ex vitro . Согласно литературным данным, регенеранты, полученные in vitro , имеют низкую выживаемость при переносе в условия ex vitro из-за формирования у них аномального устьичного аппарата [15]. Однако в литературе отсутствуют данные детальных физиологических и цитологических исследований устьиц растений-регенерантов, адаптируемых к условиям ex vitro .

В связи с этим цель данной работы заключалась в физиологической и цитологической оценке устьиц растений-регенерантов пшеницы в процессе развития in vitro , в критический момент переноса из условий in vitro в условия ex vitro и в процессе адаптации к условиям ex vitro.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования послужила яровая мягкая пшеница сорта Башкирская 26, перспективная для климатической зоны Южного Урала,[6] семена которой были любезно предоставлены к.с.-х.н. В.И. Никоновым, заведующим лабораторией селекции и семеноводства Башкирского НИИ СХ РАСХН (г. Уфа).

Предварительно было выявлено, что незрелые зародыши этого сорта пшеницы c высокой отзывчивостью формируют морфогенные каллусы в условиях культуры in vitro. Для данного эксперимента использовали растения-регенеранты в фенофазе кущения, полученные in vitro из морфогенных каллусов зародышевого происхождения, и интактные растения в той же фенофазе. Растения-регенеранты до 7-х сут фенофазы кущения выращивали in vitro в пробирках в климатической камере MLR-351H (Sanyo, Japan) при 16-часовом фотопериоде, освещенности 25000 лк. Затем их переносили в почвенную смесь и в течение 5-ти сут содержали в той же климатической камере при относительной влажности воздуха (ОВВ) 90 % и щадящем световом режиме (освещенность 16000 лк). На следующем этапе эксперимента ОВВ в климатической камере снижали до 60 %. На 8-е сут эксперимента растения-регенеранты переносили на воздух на светоплощадку при освещенности 16000 лк и 16часовом фотопериоде. С 13-х сут и до конца эксперимента освещенность составляла 25000 лк.

Интактные растения до 7-х сут фенофазы кущения и далее выращивали на светоплощадке при 16часовом фотопериоде и освещенности 25000 лк.

Для физиологической оценки реакции устьиц растений обеих групп использовали показатель устьичной проводимости, характеризующий степень открытости устьиц, что позволяет оценить интенсивность транспирации и сдвиги в водном обмене.интенсивность транспирации и сдвиги в водном обмене. Показатель устьичной проводимо- сти измеряли с помощью автоматического поро-метра (MK Delta-T, UK). Временные цитологические препараты, полученные согласно общепринятой методике [7] просматривали на микроскопе проходящего света Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Jena). Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя программы Excel с учетом основных статистических параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве точки отсчета использовали показатель устьичной проводимости «пробирочных» растений-регенерантов на 7-е сут фенофазы кущения, находящихся в климатической камере (освещенность 25000 лк), перед их высадкой в почвенную смесь. Устьичная проводимость таких растений-регенерантов составила 151 мМоль/м2с, что в 1,7 раза превышало устьичную проводимость интактных растений того же возраста (90 мМоль/м2с), растущих в почвенной смеси на светоплощадке при той же освещенности (рис. 1А). Возможно, это обусловлено более высокой относительной влажностью воздуха в пробирках.

Рис. 1 . Устьичная проводимость растений-регенерантов в процессе адаптации к условиям ex vitro в сравнении с аналогичными показателями интактных растений : А – растения-регенеранты в пробирках перед высадкой в почвенную смесь и интактные растения в почвенной смеси (освещенность 25000 лк); Б – 1-е сут эксперимента, растения-регенеранты в почвенной смеси (ОВВ 90 %, освещенность 16000 лк); В - 5-е сут эксперимента, растения-регенеранты в почвенной смеси (ОВВ 90 %, освещенность 16000 лк); Г – 7-е сут эксперимента, растения-регенеранты в почвенной смеси (ОВВ 60 %, освещенность 16000 лк); Д – 10-е сут эксперимента, растения-регенеранты в почвенной смеси (воздух, освещенность 16000 лк); Е – 15-е сут эксперимента, адаптированные растения-регенеранты и интактные растения в почвенной смеси (воздух, освещенность 25000 лк)

В критический момент переноса регенерантов в условия ex vitro показатель устьичной проводимости резко снижался (до 42 мМоль/м²с) по сравнению с «пробирочными» растениями (рис. 1Б). На 5-е сут эксперимента его значение составило 37 мМоль/м²с (рис. 1В). Уменьшение устьичной проводимости в данном случае можно расценивать как следствие фотоактивной реакции устьиц на понижение освещенности.

На следующем этапе эксперимента ОВВ в климатической камере уменьшали до 60 %. Показатель устьичной проводимости продолжал падать и на 7-е сут эксперимента достиг 30 мМоль/м2с (рис. 1Г).

На 8-е сут опыта устьичная проводимость перенесенных на светоплощадку растений-регенерантов (освещенность 16000 лк и 16-часовой фотопериод) начинала повышаться и на 10-е сут эксперимента достигла 35 мМоль/м2с (рис. 1Д), что свидетельствует о начале адаптации растений-регенерантов к изменившимся условиям.

Повышение освещенности светоплощадки до 25000 лк на 13-е сут эксперимента привело к резкому повышению показателя устьичной проводимости адаптируемых растений-регенерантов, и на 15-е сут эксперимента этот показатель (85 мМоль/м²с) был сопоставим с аналогичным показателям интактных растений (92 мМоль/м²с) (рис. 1Е). Возможно, такое резкое повышение обусловлено увеличением степени открытости устьиц под действием света. С другой стороны, оно свидетельствует о нормализации функционирования устьиц у растений-регенерантов. Степень выживаемости растений-регенерантов, по имеющимся в литературе сведениям [8,9], в среднем, составляет 50-60 %. При предложенном нами варианте постепенной адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro отмечена высокая выживаемость растений-регенерантов – 83 %.

Проведенный морфометрический анализ выявил, что устьица растений-регенерантов, адаптированных к условиям ex vitro (на 15-е сут эксперимента), морфологически не отличаются от устьиц интактных растений в той же фазе развития (рис. 2). В то же время устьица регенерантов имеют меньшие размеры. Так, длина устьиц растений-регенерантов составляла, в среднем, 55.04±1.45 мкм, тогда как у интактных растений она была равна 67.71±1.49 мкм.

Согласно литературным данным, уменьшение размеров устьиц характерно для растений-регенерантов и других представителей цветковых растений, причем авторы также отмечают нормальное функционирование устьиц растений-регенеранов [10-15].

Таким образом, данные по устьичной проводимости растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы, полученных in vitro и адаптированных к условиям ex vitro, свидетельствуют о нормальном функционировании устьиц при их меньших размерах. Предложенный нами вариант постепенной адаптации к условиям ex vitro позволит добиваться высокой выживаемости растений-регенерантов.

Рис. 2 . Морфология устьиц адаптированных растений-регенерантов (А) и интактных растений (Б) в фенофазе кущения на 15-е сут эксперимента.

Авторы благодарны к.б.н. Веселовой С.В. и к.б.н. Зайцеву Д.Ю. за помощь в проведении части экспериментальной работы.

Работа выполнена при поддержке РФФИ-Поволжье (грант № 08-04-97045), а также по программе «Ведущие научные школы РФ» (грант № НШ 7637.2010.4).