Адаптационная способность перспективных сортов лаванды и лавандина при культивировании in vitro и ex situ

Лаванда ( Lavandula L.) — ценная эфиромасличная, ароматическая, декоративная и лекарственная культура. К основным возделываемым эфиромасличным растениям относятся лаванда узколистная ( Lavandula an-gustifolia Mill.) и лавандин ( Lavandula ½ intermedia Emeric ex Loisel.). Они содержат эфирное масло, используемое в медицине, парфюмерно-косме-

Работа выполнялась при поддержке РНФ (грант ¹ 14-50-00079).

тической и пищевой промышленности (1). В растительном сырье также выявлены фенольные соединения, оказывающие широкий спектр физиологического действия (2). Традиционное вегетативное размножение лаванды и лавандина — сложный, длительный и не всегда эффективный процесс. Высококачественный посадочный материал эфиромасличных растений может быть получен в культуре in vitro. Биотехнологические приемы дают возможность в кратчайшие сроки получить значительное количество генетически идентичных исходному виду, сорту или форме здоровых растений при недостатке исходного материала (3, 4). Для изучения адаптивных возможностей микропобегов, выращенных in vitro, необходимо учитывать особенности функционирования антиоксидантной системы, включающей как низкомолекулярные протекторные соединения, так и специфические ферменты-антиоксиданты (5, 6).

К основным протекторным соединениям растений относятся пролин, фенольные вещества и аскорбиновая кислота. Пролин служит источником энергии, углерода и азота в условиях дефицита ресурсов, вызванного стрессом, и снижения активности ферментов синтеза (7). Фенольные соединения и аскорбиновая кислота участвуют в основных процессах жизнедеятельности растительных клеток: фотосинтезе, дыхании, защите от действия стрессовых факторов (8, 9). Ферменты антиоксидантной системы супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ), а также полифенолок-сидаза (ПФО) связывают избыточные количества активных форм кислорода (АФК), останавливают свободнорадикальные цепные реакции и тем самым регулируют окислительные процессы, происходящие в растительном организме (10-12). Активность окислительно-восстановительных ферментов зависит от восприимчивости организма к воздействию стрессовых факторов и стадии развития растений (13).

Чувствительным параметром изменения функционального состояния растений также служат фотосинтетическая активность и индекс жизнеспособности. Амплитудно-фазовые характеристики индукционного сигнала коррелируют с физиологическим состоянием ткани. Чем больше скорость и величина изменения оптических показателей, тем выше функциональная активность растительного организма (14). Устойчивость хлоро-филлсодержащих тканей к избыточной освещенности широко используется в экспериментальной биологии как интегральный критерий функционального состояния растений и адаптивности к неблагоприятным факторам среды (15, 16). Свето-темновая кинетика обсуждается в связи с реакцией фотосистем I и II на изменяющиеся условия культивирования (17, 18) и воздействия факторов абиогенной природы (19, 20).

Приспособление к новым условиям культивирования, а именно перенос растительного материала из открытого грунта в условия асептической культуры (in vitro), имеет комплексный характер и основывается на лабильности и толерантности биохимических и физиологических параметров, пределы которых обусловлены генетической природой организма. Несмотря на высокую хозяйственную ценность лаванды и лавандина, сведений об адаптационном потенциале этой культуры в условиях in vitro недостаточно. В настоящем сообщении нами впервые дана сравнительная физиологобиохимическая характеристика перспективных сортов лаванды и лаванди-на при различных условиях культивирования.

Цель работы — выявление адаптационной способности ценных сортов лаванды и лавандина в условиях in vitro и ex situ с помощью определения их физиологических и биохимических параметров.

Методика. В качестве объектов исследования были выбраны цен- ные сорта лаванды узколистной (Белянка, Рекорд) и лавандина (Рабат, Снежный Барс) селекции Никитского ботанического сада (НБС-ННЦ, Крым), находящиеся в генофондовой коллекции. Для физиолого-биохимических исследований отбирали интактные растения в фенофазу технической зрелости, выращиваемые ex situ на коллекционных участках НБС-ННЦ, а также микропобеги, культивируемые in vitro. Пробы отбирали во II и III декадах июля 2016 года.

В культуру in vitro вводили апикальные меристемы пазушных почек. Микропобеги культивировали в течение 4-5 мес на модифицированной среде Мурасиге-Скуга, дополненной 0,3 мг/л кинетина, 0,025 мг/л а -наф-тилуксусной кислоты и 0,25 мг/л гибберелловой кислоты («Sigma», США), 30 г/л сахарозы и 8 г/л агара («Panreac», Испания). Экспланты в культуральных сосудах помещали в камеру искусственного климата MLR-352-PE («Panasonic», Япония) с температурой 25±1 ° C, 16-часовым фотопериодом и интенсивностью освещения 37,5 µ М•м^-2•с^-1.

Биохимические показатели определяли общепринятыми методами: содержание пролина — по модифицированной методике Чинарда с использованием нингидринового реактива (21), сумму фенольных веществ — спектрофотометрически с реактивом Фолина-Чокальтеу («AppliChem GmbH», Германия) (22). Калибровочные кривые для оценки содержания пролина строили, используя L-пролин («AppliChem GmbH», Германия), фенольных веществ — галловую кислоту («Sigma», США), флавонолов — рутин («Sigma», США). Количество аскорбиновой кислоты определяли йодометрическим титрованием (23), активность каталазы (КФ 1.11.1.6) — титриметрическим методом (24), полифенолоксидазы (КФ 1.14.18.1) — в присутствии пирокатехина («Sigma», США) и п-фенилендиамина (25), суперок-сиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) — по реакции окисления кверцетина («Sigma», США) (26). В работе использовали спектрофотометр Evolution 220 UV/VIS («Thermo Fisher Scientific», США).

При культивировании растений в открытом грунте в качестве физиологических критериев, характеризующих водный режим, оценивали общую оводненность листьев, фракционный состав воды и водный дефицит (27). Параметры фотосинтетической активности измеряли при помощи портативного флуориметра Флоротест (Институт кибернетики им. В.М. Глушкова НАН Украины) (28). Регистрировали компоненты кинетики индукции флуоресценции Каутского — максимальное (Fm) и стационарное (Fst) значения флуоресценции после темновой адаптации. Рассчитывали индекс жизнеспособности и фотосинтетическую активность (15).

Эксперименты проводили в 3-кратной биологической и 3-крат-ной аналитической повторностях. Полученные данные обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0 («StatSoft, Inc.», США). В таблицах представлены средние значения показателей ( M ), их стандартные отклонения (±SD). Достоверность различий между вариантами оценивали по среднему арифметическому и коэффициенту вариации при P < 0,05.

Результаты. Сорт лаванды узколистной Рекорд был получен методом инцухта. Растения крупные, высотой 55-60 см, полураскидистые. Сорт среднеспелый, зимостойкий, высокоурожайный и высокомасличный. Содержание эфирного масла — 1,8-2,0 % от сырой массы соцветий. Основные компоненты: линалоол (34,6 %), линалилацетат (31,2 %) и 1,8-цинеол (3,7 %). Сорт Белянка — рецессивная форма сорта Рекорд, выделенная методом индивидуального отбора. Растения компактные, высотой 50-55 см. Сорт раннеспелый, низкоурожайный. Содержание эфирного масла в соцветиях — до 1 % от сырой массы. Основные компоненты: линалилацетат

(14,3 %), линалоол (63,7 %), цинеол (2,7 %), камфора (2,1 %). Сорт Снежный Барс — рецессивная форма лавандина сорта Первенец клоновой селекции. Куст компактный, высотой 80-90 см. Сорт зимостойкий, высокопродуктивный. Урожайность — 75-85 ц/га, сбор эфирного масла — 225240 кг/га, содержание эфирного масла — 3 % от сырой массы. Основные компоненты: линалоол (41,8 %), линалилацетат (19,4 %), терпинеол (7,4 %), камфора (4,9 %). Сорт Рабат — аллотриплоидный гибрид, полученный методом межвидовой гибридизации лаванды узколистной с лавандой широколистной. Растения компактной формы, высотой 120 см. Урожайность — 110-120 ц/га, сбор эфирного масла — 341 кг/га, содержание эфирного масла — 3,1 % от сырой массы. Основные компоненты: линалоол (36,7 %), линалилацетат (32,1 %), камфора (5,6 %), 1,8-цинеол (3,7 %).

Во II и III декадах июля 2016 года среднесуточная температура воздуха составляла 27,0 ° С (максимальная — 31,0 ° С). Относительная влажность воздуха — 51 %, минимальная — 47 %. Температура на почве в момент отбора поднималась до 57,5 ° С, на глубине 10 см была 30,0 ° С. По данным инструментального определения влажности почвы, запасы продуктивной влаги в метровом слое почвы — до 22 мм (14 % наименьшей влагоемкости). Бездождевой период, предшествовавший дате проведения анализов, длился 18 сут. За этот период было отмечено 6 сут с условиями, соответствующими суховею (относительная влажность воздуха опускалась до 40 %, среднесуточная температура воздуха была выше 25 ° С, порывы ветра достигали 15 м/с при средних значениях 5-8 м/с).

В открытом грунте у растений лаванды и лавандина содержание пролина имело сортоспецифичный характер (табл. 1).

1. Содержание протекторных веществ в растениях лаванды ( Lavandula angus-tifolia Mill.) и лавандина ( Lavandula ½ intermedia Emeric ex Loisel. ) разных сортов ( M ±SD, 2016 год)

Сорт	Условия	Пролин, мкг/г	Аскорбиновая кислота, мг/100 г	Фенольные соединения, мг/100 г
Белянка	Ех situ	7,69±0,23	20,06±0,58	1033±26
	Сv , %	8,5	8,2	7,1
	In vitro	8,24±0,24	5,61±0,16	645±17
	Сv , %	8,2	8,1	7,5
Рекорд	Ех situ	12,95±0,37	18,92±0,54	1181±31
	Сv , %	8,1	8,0	7,4
	In vitro	33,75±0,99	5,94±0,17	490±14
	Сv , %	8,3	8,1	8,1
Рабат	Ех situ	6,67±0,20	19,14±0,55	1305±34
	Сv , %	8,5	8,1	7,4
	In vitro	35,72±1,04	4,95±0,13	668±19
	Сv , %	8,2	7,4	8,0
Снежный Барс	Ех situ	21,59±0,63	14,96±0,44	1492±40
	Сv , %	8,3	8,3	7,6
	In vitro	35,32±1,05	5,98±0,17	777±22
	Сv , %	8,4	8,0	8,0
Примечани	е. Сv — коэффициент вариации при P < 0,05.

Известно, что пролин выполняет осморегулирующие функции и принимает участие в экспрессии генов (29). У растений, выращенных в культуре in vitro, несмотря на значительную оводненность тканей (56-62 %), количество пролина было достоверно выше, чем у интактных. Это позволяет предположить, что свободный пролин оказывает влияние на рост и дифференцировку клеток лаванды и лавандина. Условия in vitro не относятся к стрессовыми для растений в силу того, что они подбираются для оптимального развития микропобегов и характеризуются постоянными значениями температуры, влажности освещенности.

Интактные растения лаванды и лавандина накапливали высокие количества фенольных соединений и аскорбиновой кислоты. Повышение содержания фенольных соединений, как правило, служит ответной реакцией на воздействие стрессовых факторов (30). У растений в контролируемых условиях количество фенольных соединений и аскорбиновой кислоты в анализируемых образцах было достоверно ниже, что обусловлено значительной оводненностью тканей (56-62 %) и отсутствием стресса. У сортов лавандина при культивировании в открытом грунте содержание фенольных соединений оказалось достоверно больше, чем у сортов лаванды.

Растения ех situ характеризовались высокими значениями активности каталазы и супероксиддисмутазы (табл. 2).

2. Активность окислительно-восстановительных ферментов в растениях лаванды ( Lavandula angustifolia Mill.) и лавандина ( Lavandula ½ intermedia Emeric ex Loisel.) разных сортов ( M ±SD, 2016 год)

Сорт    Условия] Каталаза, г О2 •г-1•мин-1 п СОД, усл. ед/ги ПФО, усл. ед.•г-1•с-1 Белянка        Ех situ 30,68±0,87 12,98±0,32 0,524±0,013 Сv, % 8,0 6,9 7,1 In vitro 7,65±0,19 5,62±0,14 0,103±0,002 Сv, % 7,0 7,1 5,5 Рекорд         Ех situ 18,13±0,45 13,60±0,33 0,628±0,016 Сv, % 7,0 6,9 7,2 In vitro 6,80±0,16 6,12±0,20 0,101±0,003 Сv, % 6,7 9,2 8,4 Рабат           Ех situ 31,45±0,77 12,55±0,32 0,600±0,015 Сv, % 6,9 7,2 7,1 In vitro 3,68±0,09 12,43±0,31 0,112±0,003 Сv, % 6,9 7,1 7,6 Снежный Барс Ех situ 36,97±0,92 14,82±0,38 0,377±0,008 Сv, % 7,0 7,3 6,0 In vitro 2,98±0,08 10,48±0,28 0,124±0,004 Сv, % 7,6 7,6 9,1 П р и м е ч а н и е. СОД — супероксиддисмутаза, ПФО — полифенолоксидаза. Сv — коэффициент вариа- ции при P < 0,05.

В культуре in vitro активность каталазы у сортов лаванды была в 2 раза выше, чем у лавандина. В то же время активность СОД и ПФО у лаванды имела более низкие значения, чем у лавандина. Сравнительный анализ показал, что минимальные значения активности каталазы и поли-фенолоксидазы присущи сортам лаванды и лавандина, выращенным in vitro. Снижение активности ферментов обусловлено высокой оводненно-стью тканей, низким содержанием аскорбиновой кислоты и фенольных соединений, а также отсутствием стрессовых факторов. Активность СОД у сортов лавандина в культуре in vitro была сопоставима с аналогичным показателем в растениях, выращенных ех situ, а у сортов лаванды в культуре in vitro она оказалась на 50 % ниже, чем у интактных растений.

При выращивании в открытом грунте оводненность листьев составляла 56-62 % (табл. 3), на долю связанной воды приходилось 78-93 % от ее общего содержания.

3. Показатели водного режима и относительной квантовой эффективности работы фотосистемы-2 у лаванды ( Lavandula angustifolia Mill.) и лавандина ( Lavandula ½ intermedia Emeric ex Loisel.) разных сортов ( M ±SD, 2016 год)

Показатель	Условия	Сорт
		Белянка	] Рекорд	Рабат	Снежный Барс
Общее содержание воды, %	Ех situ	61,1±3,0	57,9±2,5	56,3±4,8	62,3±2,1
	Сv , %	13,9	12,2	24,1	9,5
	In vitro	76,1±3,3	72,3±2,9	77,0±2,5	74,4±3,2
	Сv , %	12,3	11,4	9,2	12,2
Фракция связанной воды, % от общего	Ех situ	78,3±4,9	90,6±3,5	82,1±4,3	93,2±1,3
содержания воды	Сv , %	17,7	10,9	14,8	3,9
	In vitro	69,5±4,1	58,1±2,2	68,3±4,8	49,4±6,1
	Сv , %	16,7	10,7	19,9	34,9

Продолжение таблицы 3

Водный дефицит, %	Ех situ Сv , %	26,9±1,4 14,7	24,8±2,9 33,1	23,1±2,9 35,5	29,1±1,2 11,6
Относительная фотосинтетическая актив-	In vitro	0,68±0,09	0,70±0,05	0,75±0,10	0,71±0,05
ность, (F m -F st )/F m	Ех situ	0,28±0,10	0,45±0,05	0,55±0,08	0,45±0,09
Индекс жизнеспособности, Fm/Fst	In vitro	2,61±0,50	2,51±0,61	3,18±0,52	2,94±0,70
	Сv , %	54,2	68,7	46,2	67,3
	Ех situ	1,41±0,03	1,71±0,12	2,36±0,37	2,00±0,36
	Сv , %	6,0	19,8	44,3	50,9

П р и м еч а ни е. F_m и F_st — соответственно максимальное и стационарное значения флуоресценции после темновой адаптации. Сv — коэффициент вариации при P < 0,05.

После длительного (18 сут) засушливого периода общее содержание воды в вегетативных органах снизилось, при этом доля связанной воды увеличилась. Максимальная водоудерживающая способность была характерна для тканей вегетативных органов у сортов Снежный Барс и Рекорд за счет фракции связанной воды. Степень водного дефицита в листьях у сортов лаванды и лавандина варьировала от 23 до 29 %. Оводненность листьев микропобегов in vitro была выше у сортов лавандина (74-77 %), достоверных различий между сортами по этому параметру не выявили. Однако наименьшая вариабельность оводненности микропобегов во время культивирования и максимальное значение соотношения связанной к свободной фракции воды позволило выделить сорта Рабат и Белянка.

Изменения в водном режиме отразились в большей степени на фотосинтетической активности сортов лаванды. У них отмечали снижение относительной квантовой активности работы фотосистемы II, фотохимических реакций и эффективности захвата энергии открытыми реакционными центрами. Индекс жизнеспособности всех изученных сортов находился в пределах нормы, но у лавандина сорта Рабат он был достоверно выше.

Из апикальной меристемы в условиях in vitro через 5-6 субкультивирований образовывалось в среднем от 2 до 5 микропобегов высотой 2382 мм, на каждом микропобеге — от 10 до 26 листьев, листья ланцетные, длиной 9-15 мм. У микропобегов выявили высокую фотосинтетическую активность листьев. При культивировании в контролируемых условиях in vitro и нахождении на относительно гетеротрофном типе питания индекс жизнеспособности также был в норме, его значения имели сортоспецифический характер. Показатели функционального состояния изученных растительных организмов in vitro свидетельствуют об отсутствии фотоингибирования, нормальном функционировании фотосистем как при работе светособирающих комплексов, так в момент окисления доноров электронов в реакционном центре фотосистемы II.

Таким образом, в открытом грунте у растений лаванды и лаванди-на содержание фенольных соединений, аскорбиновой кислоты и активности каталазы, супероксиддисмутазы, полифенолоксидазы были максимальными. По этим параметрам не выявлены существенные различия между сортами лаванды и лавандина. У микропобегов в условиях in vitro количество пролина оказалась выше, а содержание фенольных соединений, аскорбиновой кислоты и ферментативная активность — ниже, чем у интактных растений. Изменения в водном режиме у исследуемых сортов в большей степени отразились на фотосинтетической активности сортов лаванды. Индекс жизнеспособности находился в пределах нормы, фотоингибирование отсутствовало. Установлено, что адаптивный потенциал сортов лавандина при разных условиях культивирования выше, чем у сортов лаванды.