Культуры in vitro. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Лаванда узколистная (Lavandula angustifolia Mill.) и лавандин (Lavandula х intermedia Emeric ex Loisel.) - перспективные эфиромасличные растения, обладающие лекарственными, ароматическими и декоративными свойствами. В настоящей работе мы впервые дали сравнительную физиолого-биохимическую характеристику перспективных сортов лаванды и лавандина при различных условиях культивирования. Целью работы было выявление адаптационной способности ценных сортов лаванды и лавандина в условиях in vitro и ex situ с помощью определения их физиологических и биохимических параметров. В качестве объектов исследования были выбраны ценные сорта лаванды узколистной (Белянка, Рекорд) и лавандина (Рабат, Снежный Барс) селекции Никитского ботанического сада. Для физиолого-биохимических исследований отбирали интактные растения в фенофазу технической зрелости, а также микропобеги, культивируемые in vitro. Пробы отбирали во II и III декадах июля 2016 года. Культивирование микропобегов (4-5 мес) проходило на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга, дополненной кинетином (0,3 мг/л), α-нафтилуксусной кислотой (0,025 мг/л) и гибберелловой кислотой (0,25 мг/л)...
Бесплатно
Внутрикаллусная изменчивость удвоенных гаплоидов риса, полученных в андрогенезе in vitro
Статья научная
Андрогенез in vitro - один из ведущих методов при создании исходного материала для селекции сельскохозяйственных культур. Многие селекционеры считают семенное потомство любого удвоенного гаплоида новой линией вне зависимости от того, с какого каллуса она получена. Однако в полевых условиях линии с одного каллуса часто выглядят одинаково и выбраковываются. Известно около 100 генов устойчивости к грибному возбудителю пирикуляриоза риса Pyricularia oryzae Cav. [ Magnaporthe grisea (Hebert Barr.)]. В число наиболее актуальных генов для российского Дальнего Востока входят Pi-ta и Pi-ta2 . В настоящей работе впервые выявлен внутрикаллусный морфологический полиморфизм и генетическая вариабельность удвоенных гаплоидов риса Oryza sativa L., полученных в андрогенезе in vitro гибридного растения, по генам устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta и Pi-ta2 вследствие гаметоклональной и сомаклональной изменчивости. Впервые среди удвоенных гаплоидов одной каллусной линии продемонстрирована мономорфность (отсутствие генетической вариабельности), обусловленная клональным размножением (митотическим делением) клеток каллуса. Целью нашей работы было изучение внутрикаллусной морфологической и генетической изменчивости удвоенных гаплоидов риса Oryza sativa L., полученных в андрогенезе in vitro гибридного растения. Опыты проводили в ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки (Россия) и Институте селекции зерновых культур Хейлунцзянской академии сельскохозяйственных наук (Китай) в 2017-2018 годах. В качестве исходного растения для получения удвоенных гаплоидов риса использовали гибрид F1 сортов Дон 4237 ½ Долинный. Сорт Долинный служит носителем аллелей генов Pi-ta и Pi - ta2 , определяющих устойчивость к пирикуляриозу. В культуру in vitro было введено 386 гибридных пыльников. Каллусообразование составило 17,1 %. Сформировалось 18 каллусных линий с зелеными регенерантами, из которых для эксперимента отобрали шесть. По два семени каждой линии удвоенных гаплоидов высевали в почвогрунт в пластиковых стаканчиках и выращивали в условиях культуральной комнаты при 24 °С, 5000 лк и режиме 16 ч (день)/8 ч (ночь). Через 90 сут после посева одно растение срезали и определяли окраску среза (наличие/отсутствие антоцианового пигмента). Отмечали следующие фазы роста и развития растений: поздняя стадия кущения, выход в трубку, выметывание, цветение. Удвоенные гаплоиды, находящиеся на первых двух указанных стадиях, были объединены в группу поздних. Ранними считали растения, достигшие фазы выметывания и цветения. После созревания отмечали дискретные признаки: наличие или отсутствие остей, их длину и окраску. ДНК выделяли из свежих листьев СТАВ-методом. Качество и количество ДНК определяли методом электрофореза в 1,0 % агарозном геле. Аллели генов Pi-ta и Pi - ta2 , определяющие устойчивость к пирикуляриозу, выявляли методом полимеразной цепной реакции. В качестве позитивного контроля для гена Pi-ta использовали растения китайского моногенного сорта K12, для гена Pi - ta2 - сорта K27. Установлено, что удвоенные гаплоиды двух каллусных линий 7.2.2 и 21.2.1 были мономорфными, без генетической изменчивости по обоим генами устойчивости Pi - ta и Pi-ta2 . Семена растений каждой каллусной линии 7.2.2 и 21.2.1 в дальнейшем будут объединены в две отдельные селекционные линии, а большее число семян позволит интенсифицировать селекционный процесс. Среди удвоенных гаплоидов четырех других изученных каллусных линий (1.2.1, 4.1.2, 8.2.1 и 36.2.3) нами выявлен полиморфизм по остистости, скорости развития растений и антоциановой окраске среза. У каллусной линии 8.2.1 обнаружена генетическая изменчивость: 10 растений несли аллели устойчивости по обоим генам ( Pi-ta и Pi-ta2 ), 8 растений не имели ни одного аллеля, у 26 растений был детектирован только определяющий устойчивость аллель гена Pi-ta2 . Таким образом, при каллусообразовании в андрогенезе in vitro происходят два разнонапра
Бесплатно
Статья научная
Несмотря на значительную экономическую выгоду при выращивании вьетнамского женьшеня ( Panax vietnamensis Ha et Grushv.), или женьшеня Ngoc Linh, в качестве лекарственного растения, масштабы его культивирования не расширяются из-за ограниченного количества посадочного материала. Предприняты значительные исследовательские усилия по разработке систем культуры тканей у вьетнамского женьшеня, однако его микроразмножение все еще сопряжено с трудностями. Нами предложен протокол микроразмножения вьетнамского женьшеня посредством соматического эмбриогенеза in vitro в культуре незрелых зиготических зародышей. Частота прямого соматического эмбриогенеза из незрелых зиготических зародышей на основной среде Schenk и Hildebrandt (SH) с 7 % сахарозы составила 44,33 %. Вторичный соматический эмбриогенез с коэффициентом пролиферации 26,71 индуцировали в жидкой культуре с встряхиванием в течение 4 нед в среде 1/2 SH с кинетином (0,1 мг/л) и тидиазуроном (0,1 мг/л). Среда SH с добавлением a-нафтилуксусной кислоты (НУК, 1 мг/л), 6-бензиладенина (6-БАП, 0,5 мг/л) и гибберелловой кислоты (5 мг/л) стимулировала прорастание соматических зародышей и раннее образование микроризомов. Далее у двух 10-недельных культур на среде SH с НУК (0,5 мг/л), 6-БАП (1 мг/л) и 4 % сахарозы в результате микроразмножения были получены проростки с хорошо развитой корневой системой и утолщенным микроризомом со спящей почкой. Акклиматизация микроразмноженных проростков, высаженных почву, состоящую из смеси лесного перегноя с песком в соотношении 1:2, прошла успешно с выживаемостью 91,67 %. Таким образом, для женьшеня Ngoc Linh разработан эффективный протокол микроразмножения на основе культуры in vitro незрелых зиготических зародышей, который состоит из пяти этапов, включая индукцию эмбриогенеза, пролиферацию соматических зародышей, прорастание соматических зародышей, развитие проростков и акклиматизацию проростков.
Бесплатно
Статья научная
Соя Glycine max (L.) Merr. - важнейшая продовольственная, техническая и кормовая культура. В настоящее время широкое распространение в мире получает выращивание генно-модифицированных растений сои с повышенной устойчивостью к гербицидам и вредителям, а также пониженным содержанием линоленовой кислоты по сравнению с сортами и гибридами традиционной селекции. Более 85 % трансгенных растений сои было получено методом агробактериальной трансформации. К настоящему времени разработаны протоколы агробактериальной трансформации сои посредством соматического эмбриогенеза, а также прямого или непрямого органогенеза. При этом в качестве эксплантов используют семядоли, семядольные узлы, сегменты гипокотиля и эпикотиля, незрелые и зрелые зародыши. Однако, несмотря на большое число известных протоколов, генетическая трансформация сои не стала еще рутинной процедурой, поскольку существенным образом зависит от особенностей конкретного генотипа. В доступной литературе данные об использовании сегментов стебля для генетической трансформации сои практически отсутствуют, хотя этот тип экспланта широко и эффективно применяют при получении большинства трансгенных растений из класса Dicotyledoneae...
Бесплатно
Статья научная
Культура пыльников - один из эффективных методов создания чистых линий за короткое время. С его помощью можно ускорить процесс получения F1 гибридов момордики ( Momordica charantia L., сем. Cucurbitaceae ) - экономически важной сельскохозяйственной культуры, которую возделывают в тропических и субтропических странах Южной Америки, Азии и Африки. Достаточно эффективная технология культивирования пыльников момордики пока что не разработана. В настоящем исследовании мы показали, что размер бутонов достоверно (p ≤ 0,05) влияет на способность формирования каллусов момордики. Выявлено, что частота каллусообразования, морфология каллусов и время начала их формирования в культуре пыльников in vitro существенно зависят от состава и концентрации регуляторов роста в питательной среде. Кроме того, впервые исследована динамика каллусообразования в процессе культирования пыльников момордики. Целью работы было изучение влияния стадии развития микроспор и состава питательных среды на способность каллусообразования в культуре пыльников in vitro...
Бесплатно
Статья научная
Работ по культуре льна крупноцветкового ( Linum grandiflorum Desf.) in vitro крайне мало и в них преимущественно рассматривается морфогенез, получение эмбриокультуры, резистентность клеточных линий. L. grandiflorum относится к декоративным культурам, подвергающимся воздействию разнообразных стрессовых факторов в условиях города. К их числу относятся поллютанты и гербициды, вызывающие окислительный стресс в растениях. Выполненное нами исследование впервые показывает различия в реакции in vitro культивируемых клеток льна крупноцветкового на действие двух стрессовых факторов - тяжелого металла кадмия и пестицида глифосата (по морфофизиологическим характеристикам и биосинтезу фенольных соединений). Целью работы была оценка ростовой активности каллусной культуры льна крупноцветкового и накопления в ней фенольных соединений, в том числе фенилпропаноидов и флавоноидов, при воздействии токсических агентов. Каллусные культуры выращивали на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2 % сахарозы и 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты...
Бесплатно
Статья научная
Культивирование in vitro клеток и тканей сельскохозяйственных культур по назначению условно можно разделить на две группы: для получения генетически измененного исходного селекционного материала и для массового клонирования уже существующих форм и сортов. Андрогенез in vitro позволяет направить развитие микроспоры с гаметофитного пути на спорофитный с формированием удвоенных гаплоидов (doubled haploids, DHs) у диплоидных видов либо фиксацией дигаплоидов (полигаплоидов) у тетраплоидных видов, которые широко применяются в селекции растений. Вариабельность растений, полученных в культуре пыльников или микроспор с одного растения-донора, в большей степени изучена на геномном и хромосомном уровне, поскольку исследователей и селекционеров в первую очередь интересует спонтанное удвоение хромосом и, как следствие, полностью гомозиготное фертильное потомство. В настоящей работе впервые выявлена частота внутрикаллусной генетической изменчивости удвоенных гаплоидов риса Oryza sativa L . , полученных в андрогенезе in vitro гибридных растений, с использованием генов устойчивости к пирикуляриозу семейства Pi (по двум и трем генам). Показано отсутствие значительного возрастания внутрикаллусной генетической изменчивости при увеличении числа детектированных генов. Мы изучили частоту возникновения внутрикаллусной изменчивости в андрогенезе in vitro у риса с целью определения степени генетической однородности удвоенных гаплоидов (DHs) от одного пыльника. Исследования проведены на удвоенных гаплоидах, полученных в андрогенезе in vitro у 13 гибридов F1 и одного гибрида F2 риса O. sativa . Выполнен молекулярно-генетический анализ 1271 растения (83 каллусных линии) на наличие аллелей устойчивости/восприимчивости следующих генов устойчивости риса к Pyricularia oryzae Cav. [ Magnaporthe grisea (Hebert Barr.)]: Pi-z , Pi-b , Pi-1 , Pi-2 , Pi-ta . У удвоенных гаплоидов идентифицировали один-четыре гена в зависимости от наличия гетерозигот в исходных гибридах. При определении одного гена у DHs частота появления вариабельных каллусных линий составляет 24,0 %, по двум генам полиморфизм встречается среди 47,7 % каллусов, по трем генам полиморфны 62,5 % каллусных линий. У одной каллусной линии представлено не более четырех комбинации аллелей генов устойчивости к пирикуляриозу риса. Различия по частоте мономорфных каллусных линий, детектированных по одному, двум и трем генам, отсутствуют (χ2 = 0,21-0,95, р = 0,33-0,65). У одной каллусной линии с одинаковой комбинацией аллелей устойчивости двух генов сформировалось до 66 растений, с одинаковой комбинацией аллелей трех генов - до 18 растений. Зависимость полиморфизма от числа удвоенных гаплоидов на каллусной линии отсутствовала: коэффициент корреляции между числом аллелей одного гена и числом DHs - r = -0,14, между числом комбинаций аллелей по двум генам и DHs r = 0,25, между числом комбинаций аллелей по трем генам и DHs r = -0,35 (р function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }
Бесплатно
Получение гаплоидных растений Rubus arcticus L. методом культуры микроспор in vitro
Статья научная
Княженика арктическая ( Rubus arcticus L.) - ценная ягодная культура, которая используется в качестве плантационной культуры относительно короткое время. Княженика арктическая служит донором ремонтантности при межвидовой гибридизации с Rubus idaeus L., однако передает потомству низкую урожайность. Основное направление селекции R. arcticus - повышение урожайности растений, в связи с чем особое значение имеет ускорение селекционного процесса. Добиться этого можно, используя растения с удвоенным гаплоидным набором хромосом. В настоящей работе нами впервые были получены гаплоидные растения-регенеранты R. arcticus в культуре микроспор, подобрана концентрация 6-бензиламинопурина и источник углеводного питания для индукции эмбриоидогенеза. Цель нашего исследования состояла в разработке методики получения гаплоидных растений Rubus arcticus в культуре микроспор. В опытах использовали сорта княженики арктической, выведенные селекционерами в Финляндии (Pima, Mespi) и Швеции (Astra)...
Бесплатно
Сезонность андрогенетических ответов в культуре пыльников риса (Oryza sativa L.) in vitro
Статья научная
Условия выращивания растений-доноров в андрогенезе in vitro рассматриваются с позиции воздействия на растения физических факторов (освещенность, длина светового дня, температура, питание растений). Считается, что для культуры клеток и тканей in vitro подходит любой сезон, однако в отдельные периоды года культуры in vitro растут и развиваются лучше, чем в другие. Исследований, связанных с введением в культуру пыльников in vitro во все периоды года, мы не обнаружили. В настоящей работе впервые показано, что интенсивность каллусообразования и регенерации растений риса посевного ( Oryza sativa L.) различается в зависимости от месяца введения пыльников в культуру in vitro при единообразных условиях выращивания растений-доноров в течение года. Пониженная температура 21 °С позволяла получать каллус с разной интенсивностью в течение всего года, при оптимальной для риса температуре 24 °С наблюдалась большая сезонная зависимость. Нашей целью было изучение сезонной зависимости андрогенетических ответов in vitro риса при выращивании растений-доноров в контролируемых условиях климатической камеры при двух температурных режимах...
Бесплатно
Статья научная
Рис - одна из важнейших продовольственных культур юга Дальнего Востока, поэтому необходимо выведение новых сортов с повышенной урожайностью и качеством зерна. В рисосеющих странах мира, в том числе в России, для ускорения селекционного процесса и создания нового исходного материала успешно применяется культура пыльников in vitro. В ней используют метод проточной цитометрии для разделения фракций регенерантов на гаплоидые, дигаплоидные и полиплоидные растения. Цитологические исследования растений в культуре клеток и тканей in vitro свидетельствуют о существовании не только геномных изменений от гаплоидов до гексаплоидов, но и хромосомных, приводящих к анэуплоидии и эндополиплоидии. В этом случае размер генома не может быть постоянной величиной. Цель работы заключалась в характеристике популяции регенерантов риса, полученных в культуре пыльников in vitro, по содержанию ядерной ДНК методом проточной цитометрии и оценке эффективности сочетания методов культуры тканей и проточной цитометрии в селекционной работе с рисом...
Бесплатно
Статья научная
Мета-хлорбензгидрилмочевина (МХБМ) - индуктор монооксигеназной системы человека, ключевые ферменты которой относятся к суперсемейству цитохромов Р-450 (CYP). В настоящее время отсутствуют сведения о роли МХБМ в регуляции жизнедеятельности растений, однако показано участие CYP в превращении вторичных метаболитов, например флавоноидов (Фл), и большинства фитогормонов. Горькуша оргадаай ( Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob.) - малоизученный вид растений. Ее клеточная культура, в соответствии с нашими данными, 2-кратно увеличивает суммарное количество эндогенных Фл при переходе от экспоненциального роста в стационарную фазу. В настоящем исследовании впервые показаны статистически значимые (p £ 0,05) различия в ответных ростовых реакциях каллусной культуры S. orgaadayi на действие МХБМ в разных концентрациях. Выявлено, что изменение ростового индекса по сырой и сухой массе обусловлено изменением объема и формы клеток, а также частоты встречаемости разных групп клеток. Впервые исследована динамика содержания флавоноидов, сопровождающая изменения роста культуры под влиянием МХБМ. Целью работы было определение роли мета-хлорбензгидрилмочевины в накоплении флавоноидов и изменчивости цитоморфологических характеристик (линейных размеров, объема и формы клеток, частоты встречаемости разных групп клеток, ростового индекса по сырой и сухой биомассе каллуса) каллусной культуры горькуши оргадаай. Каллусную культуру, полученную на основе семядольных эксплантов из стерильных проростков, многократно пассировали на модифицированной агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением сахарозы, витаминов и регуляторов роста (0,8 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,5 мг/л 6-бензинаминопурина). Культуру выращивали в темноте при температуре 22-24 °С на среде МС с добавлением регуляторов роста и МХБМ (ООО «Синтегал», Россия) в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10; 100 мкМ. В контроле МХБМ не вносили. Продолжительность субкультивирования составила 30 сут, 2/3 растительного материала использовали для определения сырой и сухой биомассы с последующим выделением флавоноидов, 1/3 материала фиксировали в растворе Кларка в течение 2 сут. Для приготовления микропрепаратов каллусную культуру мацерировали в 3 н. растворе соляной кислоты при постоянном встряхивании до получения однородной суспензии клеток. Цитофотометрический анализ осуществляли с помощью световой микроскопии (видеокамера Moticam 2300, «Motic», Испания) с программным обеспечением. Определяли размеры 100 клеток для каждого варианта, оценивали их форму, вычисляли объем. Для расчета ростового индекса (РИ) определяли начальную (начало субкультивирования, М0) и конечную сырую или сухую массу каллусов (на 30-е сут субкультивирования, М30) и выражали в процентах к контролю: РИ = (М30 - М0)/М0. Количественное определение содержания суммы Фл в каллусной культуре осуществляли на основе их комплексообразования с хлоридом алюминия и последующего измерения оптической плотности окрашенных растворов (спектрофотометр UV-1650, «Shimadzu Corp.», Япония). В результате исследований установлено дозозависимое действие МХБМ на рост клеток за счет их деления (при 0,1 мкМ) и растяжения (1-100 мкМ), которое сопровождалось увеличением РИсыр и РИсух каллусной культуры соответственно в 2,1-3,5 и 1,5-2,9 раза (р сыр, отмеченное на среде с 1 мкМ МХБМ, происходило на фоне снижения суммы Фл на 83 %. Препарат МХБМ можно использовать в растительной биотехнологии в качестве модулятора роста клеток каллусных культур за счет снижения содержания ингибирующих рост метаболитов. Для активации клеточного деления наиболее предпочтительна доза 0,1 мкм МХБМ, тогда как для изменения содержания Фл, 2-кратно увеличивающих биомассу культуры, следует применять 100 мкМ МХБМ.
Бесплатно
