Вирусы - возбудители особо опасных инфекций: молекулярная генетика, иммуногенность, культивирование. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Вирус африканской чумы свиней (АЧС) - уникальный представитель возбудителей арбовирусных инфекций, который до сих пор остается единственным представителем семейства Asfarviridae. Он служит возбудителем одной из самых опасных болезней представителей семейства Suidae и, кроме того, способен инфицировать мягких клещей рода Ornithodoros. Генетическая и фенотипическая гетерогенность вируса АЧС остается одной из основных причин отсутствия вакцин против этого опасного трансграничного заболевания. Нами изучена структура и функции наиболее вариабельных гликопротеинов вируса АЧС p54 и CD2v с использованием биоинформатического анализа и рекомбинантных конструкций, экспрессируемых в экстрахромосомном состоянии в культурах клеток млекопитающих COS-I (клетки африканской зеленой мартышки) и HEK-293 (клетки почки эмбриона человека). Согласно результатам проведенного биоинформатического анализа, основанного на расчете индекса разнообразия аминокислотных последовательностей в пропорциях по методу Симпсона, вариабельная область (N-концевой участок) СD2v сильно гликозилирована (содержит 28-30 сайтов N- и О-гликозилирования) и находится на наружной поверхности клеточной мембраны. Эта область также содержит иммуноглобулиновый домен (1-225-я аминокислоты), что обусловливает взаимодействие СD2v с антителами. Выявленные различия в посттрансляционных модификациях и наличие генетических вариаций по белку СD2v могут объяснять разнообразие в проявлении феномена гемадсорбции у изолятов вируса АЧС. Напротив, белок p54 имеет вариабельную часть, локализованную с внутренней стороны клеточной мембраны, и гликозилированный экстраклеточный участок, расположенный с ее внешней стороны. Высокий уровень различий в нуклеотидных последовательностях гена p54 ( E183L ) у разных изолятов вируса АЧС может быть результатом мутационной изменчивости в ходе эволюции. Выявленными особенностями посттрансляционных модификаций и генетическими вариациями по белку СD2v, по всей видимости, объясняется разнообразие антигенных свойств изолятов вируса АЧС. Таким образом, в представленной работе впервые проанализирована посттрансляционная модификация наиболее вариабельных гликопротеинов вируса АЧС - p54 и СD2v. Посредством транзиентной экспрессии в клеточных линиях млекопитающих получены рекомбинантные химерные продукты p54-EGFP и CD2v-HA, что позволило выявить различную локализацию вирусных белков в трансфицированных клетках. В частности, при исследовании культуры клеток COS-I, трансфицированных плазмидой р54-pEGFP-N1, была установлена цитоплазматическая локализация флуоресцентно меченного рекомбинантного белка p54-EGFP. В культуре клеток НЕК-293 белок CD2v обнаруживался исключительно в составе клеточной мембраны. По данным иммуноблоттинга, молекулярная масса CD2v равнялась примерно 90 кДа (при расчетной 65 кДа). Следовательно, в этом поверхностном гликопротеине вириона АЧС на углеводный компонент приходится около 30 % массы. Кроме того, результаты иммуноблоттинга указывали на наличие двух вариантов белка CD2v с молекулярной массой 25 кДа и 90 кДа, то есть предположительно его различных гликозилированных форм, что согласуется с сообщениями в специальной литературе. Итак, выполненный биоинформатический анализ и результаты исследований в культурах клеток COS-I и HEK-293 показали, что именно СD2v может считаться наиболее вероятным белком-кандидатом, определяющим взаимодействие вируса АЧС с вирусоспецифическими антителами.
Бесплатно
Статья научная
Возможность распространения лихорадки долины Рифт (ЛДР) в Азию и Европу в последние десятилетия вызывает серьезные опасения. На протяжении многих лет ведутся разработки вакцин против ЛДР в нескольких направлениях, включая получение аттенуированных вакцинных вариантов вируса, инактивированных и генно-инженерных вакцин. Высокая вредоносность возбудителя ЛДР поставила перед нами задачу создания достаточно иммуногенного средства специфической профилактики ЛДР и обеспечения безопасности его производства. Поэтому целью представляемой работы стало изучение молекулярно-биоло-гических свойств аттенуированного вируса ЛДР штамм 1974-ВНИИВВиМ, в том числе поиск высокотехнологичных культуральных клеточных систем для культивирования вируса и определения его антигенного и иммуногенного родства с вирулентным штаммом Entebbe. Результаты исследований показали, что в перевиваемых культурах клеток почки сайги (ПС), почки зеленой мартышки (CV-1) и почки сирийского хомячка (ВНК-21/13) вирус накапливается в высоких титрах при инфекционной активности 8,23±0,21 lg MLD 50/см 3 и антигенной активности в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в разведениях 1:64-1:128. Нами отработаны параметры культивирования вируса роллерным методом в культуре клеток ПС: скорость вращения культуральных бутылей - 12-15 об/ч; доза заражения - 0,01-0,001 MLD 50/кл; рН 6,4-6,8 в первые 12 ч культивирования. Последующее поддержание рН в пределах 7,2-7,6 в течение 48-72 ч культивирования при 37 °С обеспечивает получение вирусного сырья с высокой инфекционной (8,5±0,2 lg MLD 50/см 3) и антигенной активностью: титр в РПГА - 1:128-1:256, при твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ-ИФА) - 1:625-1:3125. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей трех участков S- и M-сег-ментов вирусного генома, выполненный по методу максимального правдоподобия на основе модели K. Tamura и M. Nei (1993), позволил установить высокую степень родства штамма 1974-ВНИИВВиМ с известными штаммами Smithburn (аттенуированный) и Entebbe (вирулентный), что дает основание выделить их в отдельный кластер. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N, показал, что большая часть замен в последовательностях указанных генов у штамма 1974-ВНИИВВиМ вируса ЛДР синонимичны и не приводят к изменению первичных аминокислотных последовательностей, вставки и делеции отсутствуют. В нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин Gn штамма 1974-ВНИИВВиМ, нами выявлены восемь замен относительно аналогичной последовательности М-сегмента генома у вирулентного штамма Entebbe и 14 замен при сравнении с М-сегментом у штамма Smithburn. У штамма 1974-ВНИИВВиМ по сравнению с другими аттенуированными штаммами установлено низкое число значимых аминокислотных замен в антигенных компонентах вируса ЛДР, что подтверждает обоснованность выбора штамма 1974-ВНИИВВиМ в качестве источника генов иммунодоминантных белков и сырья для производства вакцин.
Бесплатно
Статья научная
Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) - болезнь однокопытных, вызываемая вирусом рода Lentivirus семейства Retroviridae. Заболевание широко распространено, и его эпизоотии зарегистрированы практически на всех континентах земного шара. В Российской Федерации из года в год при плановых исследованиях на присутствие антител к вирусу ИНАН выявляются животные, серопозитивные в реакции диффузионной преципитации (РДП). В настоящее время опасность распространения вируса ИНАН признается во всем мире, а его контролю уделяется большое внимание, в связи с чем проводятся многочисленные исследования по выявлению вируса, определению его молекулярно-генетических характеристик и происхождения. В настоящей работе представлены данные по разработке тест-системы на основе ПЦР, позволяющей не только выявлять геном вируса ИНАН в различных образцах биологического материала, но и проводить дальнейшее секвенирование фрагментов генома этого инфекционного агента. Геном вируса ИНАН состоит из трех основных генов - gag, pol, env (распложены в направлении 5'→3'), из которых наиболее полезным маркером для изучения генетического разнообразия и филогенетических взаимоотношений между различными штаммами вируса ИНАН считается gag-ген, необходимый для внутриклеточной сборки и выхода вируса из клетки. С целью проведения молекулярно-генетических исследований нами была оптимизирована двухраундовая ПЦР без этапа обратной транскрипции и рассчитаны специфические олигонуклеотидные праймеры для второго раунда реакции, фланкирующие участок gag-гена провирусной ДНК вируса ИНАН размером 1018 п.н. В результате проведенных изысканий также были определены нуклеотидные последовательности и филогенетические отношения ранее выделенного отечественного штамма вируса ИНАН и двух современных изолятов, выявленных на территории нашей страны. Полученные данные позволили отнести штамм 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ к группе североамериканского происхождения (гомология 98 %), а изоляты Нижний Новгород-2011 и Омск-2012 - к группе европейских (гомология 82-83 %). Таким образом, разработанная нами система идентификации вируса ИНАН с помощью ПЦР и филогенетического анализа позволяет устанавливать принадлежность выделяемых изолятов к определенной геногруппе и, следовательно, предположить их географическое происхождение. Эта информация необходима для определения источника и путей распространения возбудителя с целью прогнозирования эпизоотической ситуации и планирования мер борьбы с болезнью.
Бесплатно
