Филогенетический анализ российских изолятов вируса инфекционной анемии лошадей с использованием оптимизированной двухраундовой ПЦР

Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) — болезнь однокопытных, которая сопровождается поражением органов кроветворения и проявляется рецидивирующей или постоянной лихорадкой, анемией и нарушением функций сердечно-сосудистой системы (1-4). Этиологический агент ИНАН имеет вирусную природу (Equine infectious anemia virus — EIAV) и относится к роду Lentivirus семейства Retroviridae (4, 5). Геном вируса ИНАН представлен двумя идентичными молекулами линейной одноцепочечной РНК позитивной полярности (4, 6-8) и состоит из трех основных структурных генов, расположенных последовательно в направлении 5′→3′, — gag (кодирует вирионные коровые белки, необходим для внутриклеточной сборки и выхода вируса из клетки), pol (кодирует полипептиды, обладающие ревертазной, специфической РНК-азной и ДНК-эндонуклеазной активностью) и env (кодирует поверхностные вирионные гликопротеины, участвует в формировании оболочки вириона, специфическом узнавании клетки-хозяина и проникновении вируса через ее мембрану) (4, 8, 9). Кроме того, геном вируса ИНАН содержит три дополнительные открытые рамки считывания, с которых экспрессируются небольшие вспомогательные белки, участвующие в регуляции синтеза и процессинге вирусной РНК, — tat, rev и S2. Вспомогательный белок S2 — важная детерминанта репликации и патогенных свойств вируса ИНАН in vivo (4, 6, 8-10). Нуклеотидная последовательность вирусного генома на обоих концах имеет длинные концевые повторы (LTR), необходимые для встраивания провирусной ДНК (пДНК) в клеточный геном (8, 11).

К вирусу ИНАН восприимчивы представители семейства лошадиных ( Equidae ) — лошади, пони, ослы, мулы и лошаки (1, 2, 12-15). Заболевание инфекционной анемией негативно сказывается на промышленном разведении лошадей. В числе 11 инфекций однокопытных ИНАН входит в список World Organization for Animal Health (Международное эпизоотическое бюро, Париж, OIE — МЭБ), включающий заболевания, о вспышках которых страны обязаны информировать МЭБ (8, 16).

В связи с регистрацией болезни практически на всех континентах (17, 18-20) большое внимание уделяется проблеме контроля за распространением вируса ИНАН. Проводимый в разных странах филогенетический анализ местных изолятов и штаммов позволяет предположить, что существуют генетические подтипы вируса ИНАН, циркулирующие в настоящее время в мире (8, 14, 17).

В Российской Федерации из года в год при плановых исследованиях на присутствие антител к вирусу ИНАН выявляются животные, серопозитивные в реакции диффузионной преципитации (РДП). Так, с 2011 по 2015 год сероположительные лошади обнаружены более чем в 25 регионах России (21-23).

Несмотря на то, что случаи выявления положительно реагирующих в РДП на ИНАН животных в Российской Федерации регистрируются регулярно, в нашей стране единственным известным вариантом вируса ИНАН остается штамм З, выделенный в Запорожье в 1967 году К.П. Юровым. Позднее этот штамм был адаптирован к культурам клеток и использован в качестве культурального под названием 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ (коллекция Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Московская обл.).

Важно отметить, что молекулярная эпизоотология вируса ИНАН в России до настоящего времени не исследована. В то же время молекулярно-генетическая оценка разнообразия изолятов вируса ИНАН и их филогенетический анализ необходимы для понимания особенностей появления и циркуляции этого вируса в нашей стране, а отсутствие таких данных служит фактором, осложняющим эпизоотическую ситуацию по ИНАН. Кроме того, изучение разнообразия российских изолятов вируса ИНАН существенно расширяет представления о генетической структуре его мировой популяции.

Нашей целью стала разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей выявлять вирус ИНАН, проводить секвенирование и анализ фрагментов его генома, а также исследовать молекулярно-генетические характеристики и филогенетические связи между известными и вновь выявляемыми изолятами этого вируса, циркулирующими на территории России.

Методика . Изучали единственный известный отечественный штамм вируса ИНАН 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ (Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Московская обл.) и два изолята, выявленные в мониторинговых исследованиях на территории РФ, — Нижний Новгород-2011 и Омск-2012 (коллекция Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии).

Множественное выравнивание и расчет праймеров для секвенирования были выполнены с помощью пакетов программ BioEdit v. 7.0 804

и Oligo v. 6.0 («Molecular Biology Insights, Inc.», США), используя нуклеотидные последовательности генома разных штаммов и изолятов вируса ИНАН, опубликованные в базе данных GenBank (the National Center for Biotechnology Information — NCBI).

Нуклеиновые кислоты выделяли из анализируемого биологического материала в соответствии с методикой, основанной на применении коммерческого реагента Trizol LS («Invitrogen», США) согласно рекомендациям производителя.

С целью накопления специфических продуктов для последующего секвенирования проводили двухраундовую (гнездовую) ПЦР без этапа обратной транскрипции с праймерами, описанными S. Capomaccio с соавт. (13) (для первого раунда ПЦР), и оригинальными праймерами (для второго раунда ПЦР). Постановку гнездового варианта ПЦР и оптимизацию температурных режимов реакций осуществляли в термоциклере Gradient Palm Cycler («Corbett Research», Австралия).

Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,001 % бромистого этидия. Специфические продукты амплификации экстрагировали из агарозного геля, используя коммерческие наборы AxyPrep DNA Gel Extraction Kit («Axygen Scientific, Inc.», США) и QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen N.V.», Германия).

Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК по Сэнгеру выполняли в автоматическом анализаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США) с использованием набора реактивов Big Dye v. 3.1. Terminator и 5½Sequencing buffer («Applied Biosystems», США) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма Neighbor-Joining с применением численного ресамплинга, или методов генерации повторных выборок, в программе MEGA v. 5.0 (24).

Результаты . Наиболее информативным маркером для изучения патогенности и генетического разнообразия между различными штаммами вируса ИНАН считается gag -ген, кодирующий основные матричные и капсидные белки, в связи с чем он часто используется в молекулярно-генетических исследованиях (13, 14, 17). Поэтому для оценки филогенетического родства между выявленными на территории России и зарубежными штаммами и изолятами вируса ИНАН, геномы которых представлены в GenBank, мы определили нуклеотидную последовательность именно этого гена.

Для амплификации фрагмента gag -гена были использованы праймеры, описанные S. Capomaccio с соавт. (13). Эти праймеры (EIAV 1B и EIAV 5) фланкируют область вирусного генома размером 2233 п.н., включающую участок гена tat от экзона 1, полный gag -ген и начало нуклеотидной последовательности рol -гена. Постановку ПЦР осуществляли при градиенте температур 50-59 ° С; положительным контролем служила нуклеиновая кислота штамма 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ. Однако анализ электрофореграмм полученных амплифицированных фрагментов показал, что используемые праймеры работают только при очень низкой температуре отжига (50-54 ° С) и дают несколько неспецифических продуктов.

Чтобы увеличить выход специфического продукта, мы рассчитали олигонуклеотидные последовательности праймеров для второго раунда гнездовой ПЦР. Эти праймеры (EA Fw/N2 и EA Rev/N2) фланкируют участок gag-гена размером 1018 п.н. внутри фрагмента, который, в свою очередь, фланкируют праймеры EIAV 1B и EIAV 5. Для постановки ПЦР с рассчитанными праймерами нами были подобраны условия: состав смеси, кон- центрация праймеров, dNTPs, количество вносимой полимеразы и температурно-временные режимы.

В пределах от 51 до 60 ° С температура 56 ° С была оптимальной для гибридизации EA Fw/N2 и EA Rev/N2 (рис. 1). Смесь для амплификации включала праймеры (по 10 пмоль каждого: EIAV 1B и EIAV 5 — для первого раунда, EA Fw/N2 и EA Rev/N2 — для второго) — 2,0 мкл; dNTPs («Fermentas», Латвия) (10 мМ) — 1 мкл; 5½ буфер для ПЦР из набора реагентов АмплиСенс Blue (Россия) — 5 мкл; Taq ДНК-полимеразу («Евроген», Россия) (2,5 ед.) — 0,4 мкл; исследуемый образец нуклеиновой кислоты — 8 мкл; деионизированная вода — до 25 мкл. В гнездовой ПЦР первый раунд амплификации (с праймерами EIAV 1B и EIAV 5) проводили при 52 ° С, второй (с праймерами EA Fw/N2 и EA Rev/N2) — при 56 ° С. Праймеры EA Fw/N2 и EA Rev/N2 также использовались для секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации участка gag -гена (1018 п.н.) вируса инфекционной анемии лошадей во втором раунде ПЦР с рассчитанными олигонуклеотидными праймерами: К - — отрицательный контроль, К + — штамм 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ; М — маркер молекулярных масс 100 bp Ladder DNA Marker («Axygen», США). Стрелкой отмечен фрагмент 1000 п.н.

Оптимизированный протокол двухраундовой ПЦР позволил перейти к основной задаче работы — впервые определить молекулярно-генетические характеристики штамма 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ и двух изолятов вируса ИНАН (Нижний Новгород-2011 и Омск-2012), выявленных при вспышках болезни в Российской Федерации (25), на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента gag -гена (участок размером 1018 п.н.).

При сравнении участков геномов отечествен ного штамма и изолятов с таковыми у референтных зарубежных штаммов из GenBank с помощью программы BioEdit v. 7.0 были выявлены многочисленные нуклеотидные замены. На основании множественного выравнивания и анализа полученных нами и размещенных в GenBank нуклеотидных последовательностей генома вируса ИНАН с помощью программы MEGA v. 5.0 была построена дендрограмма, отражающая филогенетические отношения изолятов и штаммов, взятых для сравнения (рис. 2).

Как видно из дендрограммы, штамм 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ входит в один кластер со штаммами V70 и V26 (степень нуклеотидной идентичности — 98 %). По данным литературы, штаммы V70 и V26, выделенные в Японии, получены при пассировании североамериканского штамма EIAV_Wyoming (Вайоминг) на естественно восприимчивых животных и входят с ним в одну генетическую группу (8, 9) с уровнем внутригрупповых различий, не превышающим 5 %. Гомология нуклеотидной последовательности участка gag -гена штаммов 3-К-ВНИИТИБП-ВИЭВ и EIAV_Wyoming также составила 98 %.

Изоляты, выявленные на территории России в период с 2012 по 2014 год (Нижний Новгород-2011 и Омск-2012), оказались филогенетически наиболее близки к группе европейского происхождения. Самую высокую гомологию по нуклеотидным последовательностям участка gag -гена (1018 п.н.) отмечали между изученными российскими изолятами и 806

образцами из Германии (83 % для изолята EIAVGER-7) и Италии (82 % для изолята Ita87).

|AF033820.1|strain Wyoming (USA)

NC 001450.1 |NCBI Reference Sequence(USA)

|AF016316.1|EIAVuk (United Kingdom)

|AF247394.1| Equine infectious anemia virus complete genome (USA)

strain 3K-VNIITIBP-VIEV

6Яг |AB008196.1 |strain V70(Japan) 541— |AB008197.1|strain V26(Japan)

- |EF418582.1 |strain Can1 (Canada)

--------------------|HM177435.1| isolate 71 (Italy)

& |HM 177438.11 isolate 73 (Italy)

|EU741609.1|EIAV clone lta-4 (Italy)

|EU240733.1|EIAV clone lta-1 (Italy)

- isolate Niz.Novgorod-2011

----isolate Omsk-2012

|KF878269.11 isolate EIAVGER-7 (Germany)

-------IHQ888861.11 isolate Ita87 (Italy)

100 I-------------|GQ923952.1| EIAV clone Rom-2 (Roman)

I---------------|GU060663.1| EIAV clone Rom-5 (Roman)

----------------------|JX193070.1|strain Assebroek (Belgium)

-----------------------|HQ888862.1| isolate lta90 (Italy)

---------------------------JX003263.1 |strain Miyazaki2011-A (Japan)

-------|AB693823.1|strain Goshun (Japan)

86 r |GU385359.1| isolate FDDV-9 tat (China)

"L |GU385357.1| isolate FDDV-7 (China)

)91 |AF327877.1|strain Liaoning (China)

|GU385365.1| isolate LN-5 (China)

• - IHM141910.11 isolate DV10-3 (China)

• ■ |HM141913.11 isolate DLV3-A (China)

|AF327878.1|vaccine strain (China)

47L |HM141921.11 isolate DLV5-10 (China)

Рис. 2. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения между различными штаммами и изолятами вируса инфекционной анемии лошадей. Построена на основе анализа нуклеотидных последовательностей участков gag -гена (1018 п.н.) с использованием алгоритма Neighbor-Joining в программе MEGA v. 5.0.

Нуклеотидные последовательности участка gag -гена штамма 3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ и изолята Нижний Новгород-2011 вируса ИНАН были депонированы в международный банк данных GenBank (¹ KM202106 и (¹ KM248275) и в настоящее время доступны для других исследователей.

Таким образом, рассчитаны оригинальные праймеры и оптимизированы условия постановки гнездовой ПЦР, что позволило амплифициро-вать специфический участок (1018 п.н.) генома вируса инфекционной анемии лошадей в области gag -гена, широко используемого для оценки генетического разнообразия и родства изолятов. При этом нами впервые определен фрагмент нуклеотидных последовательностей геномов отечественного штамма вируса ИНАН и двух современных изолятов, обнаруженных на территории России. Данные выполненного секвенирования и филогенетического анализа позволили отнести штамм 3-К-ВНИИТИБП-

ВИЭВ к группе североамериканского происхождения. Кроме того, нам удалось установить наибольшую гомологию изолятов Нижний Новгород-2011 и Омск-2012 с изолятами европейского происхождения.