Молекулярные и клеточные технологии. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Выделение, культивирование и характеристика примордиальных зародышевых клеток перепелов
Статья научная
Использование примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) птицы для получения химерных и трансгенных особей рассматривается как альтернатива традиционным методам селекции и трансгенеза. Такой подход предусматривает введение донорских примордиальных зародышевых клеток в дорсальную аорту эмбрионов-реципиентов в период миграции этого типа клеток из крови в гонады. В случае колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов возможна дальнейшая дифференцировка донорских клеток до зрелых половых клеток (как мужских, так и женских). При этом ключевой фактор, определяющий эффективность проводимых манипуляций, - использование чистой популяции зародышевых клеток. В этой связи остается актуальной разработка способов выделения и поддержания в культуре ПЗК - предшественников половых клеток. Целью наших исследований была оптимизация приемов получения и культивированию примордиальных зародышевых клеток перепелов ( Coturnix coturnix ). ПЗК выделяли из 5-6-суточных эмбрионов, применяя два методических подхода - механическую диссоциацию и ферментативную обработку. Механическую диссоциацию клеток проводили посредством измельчения эмбрионов с помощью пипетирования в среде DMEM в течение 5 мин. При ферментативной обработке эмбрионов в качестве протеолитического фермента использовали раствор трипсина (0,05; 0,10; 0,15 и 0,25 %). Для повышения доли ПЗК в получаемой суспензии эмбриональных клеток их разные типы разделяли по способности к адгезии. Морфологическую оценку свежевыделенной популяции эмбриональных клеток проводили визуально под фазово-контрастным микроскопом («Nikon», Япония). Для идентификации ПЗК в культуре применяли гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание. Установлено, что ферментативная обработка 0,05 % трипсином служит эффективным методом дезагрегации эмбрионов с сохранением жизнеспособности значительной доли (94 %) клеток. Разделение клеток разных типов с учетом их способности к адгезии позволило получать культуру ПЗК, максимально очищенную от других типов клеток. Единичные эмбриональные фибробласты, оставшиеся в клеточной суспензии ПЗК после отделения других клеток, при последующем культивировании служили фидерным слоем, на который прикреплялись ПЗК. Первичные собственные эмбриональные фибробласты оказались оптимальным фидерным слоем для краткосрочного культивирования ПЗК по сравнению с клетками ïåðåâèâàåìûõ ýìáðèîíàëüíûõ ôèáðîáëàñòîâ ìûøè ëèíèè STO и культивируемыми эмбриональными фибробластами. При использовании ростовой среды на основе DМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненной фетальной сывороткой крови крупного рогатого скота (20 %), глутамином (2 мМ), 2-меркаптоэтанолом (10-6 мМ), LIF (leukemia inhibitory factor, 2 нг/мл), незаменимыми аминокислотами (MEM, 10 мM), антибиотиком гентамицином (50 мкг/мл), прикрепление ПЗК к фидерному слою наблюдали на 1-2-е сут культивирования с формированием колоний на 3-и-4-е сут. Наличие колоний ПЗК было подтверждено иммуногистохимически с помощью специфических первых антител к SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1).
Бесплатно
Оценка биоразнообразия у межвидовых гибридов рода Ovis с использованием STR- и SNP-маркеров
Статья научная
Интрогрессия диких и домашних родственных видов рассматривается как перспективный способ повышения генетического разнообразия в популяциях сельскохозяйственных животных. Нашей целью стало изучение влияния интрогрессии дикого вида (архара) на генетическое разнообразие межвидовых гибридов с домашними овцами с использованием STR- и SNP-маркеров. Объектом исследований были исходные родительские формы - овцы романовской породы Ovis aries (ROM, n = 35, материнская «домашняя» форма) и архары O. ammon polii (OAM, n = 10, отцовская «дикая» форма); гибридный самец F1 от скрещивания романовской овцы и архара (50 % крови архара); возвратные кроссы, полученные скрещиванием ярок романовской породы с гибридными самцами F1 (BC1, 25 % крови архара, n = 38) и BC1 (BC2, 12,5 % крови архара, n = 14). Полиморфизм 11 STR-локусов (BLT001B, CSRD247, FCB20, CSAP36, MAF65, McM147, OarCP49, D5S2, HSC, BMS2213 и INRA23) определяли на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130xl («Applied Biosystems», США). Для генотипирования SNP использовали ДНК-чип Ovine SNP50K BeadChip («Illumina Inc.», США). После контроля качества для анализа были сформированы панели из 9 локусов STR и 8591 локусов SNP. Статистические расчеты проводили в программах GenAIEx 6.5, PLINK v1.07, HP-Rare 1.1, GENETIX 4.05 и STRUCTURE 2.3.4. Вне зависимости от используемого типа ДНК-маркеров у ROM по сравнению с OAM установлена более высокая степень генетического разнообразия, оцененного по показателям наблюдаемой гетерозиготности (Ho) и аллельного разнообразия (Ar). Гибридизация приводила к увеличению этого показателя у F1. В группах BC1 и BC2 значения Ho, рассчитанные по STR и SNP, превышали таковые у исходных родительских форм. Ar, рассчитанное по SNP, в группах BC1 и BC2 снижалось по сравнению с F1 и характеризовалось промежуточными значениями по сравнению с родительскими формами. При использовании STR четких изменений Ar в группах BC1 и BC2 не выявили. Результаты анализа главных компонент (PCA) более объективно описали распределение исследуемых животных в пространстве координат (согласно происхождению) при использовании SNP-маркеров. Уже PC1 позволяла четко дифференцировать группы OAM, ROM, F1 и BC1 + BC2. Суммарно первые две компоненты (PC1 и PC2) отвечали за 25,87 % изменчивости SNP-маркеров и лишь за 12,46 % изменчивости STR-маркеров. Компонента PC3, которая отвечала за 6,16 % изменчивости SNP-маркеров, позволяла дифференцировать группы BC1 и BC2, в то время как при использовании STR эти группы локализовались в виде общего массива. Результаты анализа в STRUCTURE показали, что объединение изучаемых особей в кластеры по STR-профилям не отражало реальной популяционной принадлежности животных, в то время как формирование кластеров на основании SNP-маркеров соответствовало фактическому происхождению индивидуумов. Таким образом, оба типа изучаемых ДНК-маркеров подходят для детектирования изменений генетического разнообразия в поколениях гибридов. Тем не менее, выявлено значительное преимущество множественных SNP-маркеров при дифференциации гибридных животных от родительских форм.
Бесплатно
