Оценка биоразнообразия у межвидовых гибридов рода Ovis с использованием STR- и SNP-маркеров

Основные эволюционные рычаги, такие как рекомбинации и естественный отбор, действуют медленно и за редким исключением приводят к определенному эффекту по прошествии длительного времени, однако посредством интрогрессивной гибридизации эти события могут быть значительно ускорены (1-5). Интрогрессивная гибридизация представляет собой процесс включения аллелей одного вида в генофонд другого на основе повторяющегося возвратного скрещивания межвидового гибрида с одной из родительских форм (6-9). В природе интрогрессия, как правило, происходит между близкородственными видами (10, 11), а также характерна для гибридных зон, или зон контакта двух видов (1). Тем не менее, наиболь-

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект ¹ 14-36-00039.

ший интерес представляет отдаленная, или межвидовая, гибридизация.

Интенсификация животноводства и длительная однонаправленная селекция, в том числе использование родственных линий или кроссов, приводят к снижению генетического разнообразия и усилению негативных последствий инбридинга, в частности к ухудшению адаптационных способностей животных. В этом случае дикие формы рассматриваются как уникальные резервуары генетической изменчивости для своих домашних сородичей (12).

В большинстве случаев межвидовые гибриды бесплодны и не способны передать свои уникальные свойства потомству (13). Однако существуют исключения. Так, потомки пиренейского козерога ( Capra pyrenaica ) и домашней козы ( Capra hircus ) сохраняют способность к размножению (5). Гибриды домашнего крупного рогатого скота ( Bos taurus ) с индийским скотом ( Bos indicus ) (14), американским бизоном ( Bison bison ), зубром ( Bison bonasus ) (13, 15), бантенгом ( Bos javanicus ) и гауром ( Bos gaurus ) фер-тильны (16, 17). Потомство от скрещивания домашней овцы с дикими видами — архаром ( Ovis ammon ), муфлоном ( Ovis orientalis musimon ), снежным бараном ( Ovis nivicola ) плодовито и может быть основой для создания новой селекционной формы овец, отличающейся превосходной адаптацией к сложным рельефным и природно-климатическим условиям и служащей источником диетического мяса (18, 19).

Плодовитость потомства от скрещивания овец разных пород с муфлонами была показана в многочисленных экспериментах (20, 21) и в природных условиях, что ставит под сомнение существование генетически чистых популяций этого копытного (22). В 1934-1950 годах в Казахстане на основе межвидовой гибридизации архара и домашних овец породы казахский меринос была выведена порода казахский архаромеринос, которая оказалась хорошо приспособлена к разведению в горных районах (19, 23).

Получение объективных данных о степени интрогрессии и изменении аллелофонда пород под влиянием гибридизации определяется прежде всего адекватным выбором типа ДНК-маркеров. Одним из наиболее популярных маркеров для детектирования межвидовых гибридов до недавнего времени служил полиморфизм митохондриальной ДНК (мтДНК) (1, 24-26).

Однако у этого подхода имеются существенные недостатки. Во-первых, не учитывается генетический вклад самца в интрогрессию. Во-вторых, анализ мтДНК не позволяет оценить размер и характер изменений, затрагивающих ядерную, или нуклеарную, ДНК (яДНК) гибридов. Контрастные генетические закономерности для ядерных и митохондриальных маркеров, как правило, объясняются высоким генетическим дрейфом мтДНК за счет уменьшения эффективного размера мтДНК по сравнению с яДНК (24, 25).

Микросателлиты, или STR-маркеры (short tandem repeats), — широко распространенный тип ядерных ДНК-маркеров (27). Кодоминантные, имеющие менделевский характер наследования и пригодные для анализа в автоматизированном режиме микросателлиты хорошо зарекомендовали себя для идентификации, характеристики аллелофонда и генетического разнообразия гибридов близкородственных видов (28-32). В то же время M.G. Sovic с соавт. (33) ставят под сомнение применение микросателлитов для оценки гибридизации более отдаленных видов.

С развитием современных высокопроизводительных технологий генотипирования SNP-маркеры (single nucleotide polymorphisms) становятся многообещающими инструментами для исследования интрогрессивных 252

изменений в геноме (33-35). Преимущество SNP — возможность идентификации локусов с фиксированными аллелями, специфическими для каждого из родительских видов (36, 37). Детектирование таких локусов, как правило, — несложный и быстрый процесс. Применение полногеномных ДНК-платформ позволяет найти несколько сотен локусов (38). Результаты, получаемые при сравнении двух таксонов и их гибридов с использованием диагностических локусов, однозначны и высокодостоверны (39).

Во Всероссийском НИИ животноводства им. Л.К. Эрнста создана уникальная модельная популяция межвидовых гибридов домашних овец ( O. aries ) романовской породы и архара памирской популяции ( O. ammon polii ), которая на сегодняшний день включает две генерации потомков от возвратного скрещивания романовских овец с гибридными самцами. В представленной работе впервые были детально изучены изменения генетических параметров у межвидовых гибридов по сравнению с обеими родительскими формами в популяции, полученной в искусственных, а не природных условиях.

Нашей целью стала оценка влияния интрогрессии дикого вида (архара) на генетическое разнообразие межвидовых гибридов с домашними овцами, выполненная с использованием SNP- и STR-маркеров.

Методика. Объектом исследований были исходные родительские формы — овцы романовской породы O. aries (ROM, n = 35, материнская «домашняя» форма) и архары O. ammon polii (OAM, n = 10, отцовская «дикая» форма); гибридный самец F₁ от скрещивания романовской овцы и архара (50 % крови архара); возвратные кроссы, полученные скрещиванием ярок романовской породы с гибридными самцами F₁ (BC₁, 25 % крови архара, n = 38) и BC₁ (BC₂, 12,5 % крови архара, n = 14). Биоматериалом служили пробы ткани (выщип).

ДНК выделяли с помощью колонок Nexttec («Nexttec Biotechnology GmbH», Германия) и набора ДНК-Экстран (ЗАО «Синтол», Россия) согласно протоколам производителей.

Генетические исследования по STR-маркерам проводили на основе ПЦР-амплификации 11 микросателлитных локусов овец, рекомендованных ISAG (International Society for Animal Genetics) и объединенных в две мультиплексные панели — панель 1 (BLT001B, CSRD247, FCB20, CSAP36, MAF65, McM147) и панель 2 (OarCP49, D5S2, HSC, BMS2213 и INRA23). Амплификацию осуществляли в реакционной смеси (конечной объем — 20 мкл), содержащей 1 х ПЦР буфер, в состав которого входит 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 67,7 мМ Трис-HCl (pH = 8,8), 0,1 (v/v) Tween 20, а также 1,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ дНТФ, 20 пмоль каждого из праймеров, 1 U Taq ДНК-полимеразы («Диалат Лтд», Россия) и 1 мкл тестируемой ДНК (50-100 нг). После начальной денатурации (95 °С, 5 мин) проводили 35 циклов амплификации (95 °С, 20 с; 55 °С, 30 с; 72 °С, 1 мин) для панели 1 и 41 цикл амплификации (95 °С, 20 с; 63 °С, 30 с; 72 °С, 1 мин) — для панели 2. Продукты ПЦР разделяли на генетическом анализаторе PRISM 3131xl («Applied Biosystems», США). Размеры фрагментов определяли с использованием программного обеспечения GeneMapper^® Software v4 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США).

Для полногеномного SNP-сканирования использовали ДНК-чип средней плотности Ovine SNP50K BeadChip («Illumina Inc.», США). С помощью программного обеспечения PLINK v1.07 (40) выполняли контроль качества, который включал четыре этапа. На первом этапе отбирали маркеры по показателям GenCall (GC) и GenTrain (GT), используя для каждого из SNP параметры отсечения, равные 0,5 (для GC) и 0,3 (для GT).

SNP, локализованные на половых хромосомах, и с неизвестной локализацией исключали из анализа. На втором этапе определяли полиморфные SNP для родительских форм с использованием следующих фильтров: частота минорных аллелей менее 10 % (--maf 0.01), результативность гено-типированния не менее 90 % животных (--geno 0.1), тест на равновесие по Харди-Вайнбергу p < 10-6 (--hwe 1e-6). После фильтрации отбирали только SNP, общие для обеих родительских групп. На третьем этапе были идентифицированы уникальные для каждой группы мономорфные SNP, поскольку в гибридных формах они могут стать полиморфными. После этого мономорфные SNP добавляли к отобранным на первом этапе полиморфным. На четвертом этапе к родительским формам были добавлены гибридные. Фильтрация проходила по критериям GENO (--geno 0.1) и тесту на неравновесие по сцеплению LD (--indep-pairwise 50 5 0.5): в окне из 50 SNP удалялся один из пары маркеров, для которых показатель LD был выше 0,5, после чего окно смещалось на 5 SNP. Фильтры MAF и HWE на этом этапе не применяли. После проведения LD-теста был сформирован набор SNP, используемый для статистических расчетов.

Для определения основных популяционных показателей — наблюдаемой (Ho) и ожидаемой (He) гетерозиготности, коэффициента инбридинга (FIS), индекса фиксации FST (41) и генетических дистанций M. Nei (DN) (42) по STR-маркерам использовали программное обеспечение GenAIEx 6.5.1 (43), по SNP-маркерам — GENETIX 4.05 (44). Аллельное разнообразие (Аr) для каждой группы животных по STR- и по SNP-маркерам вычисляли в программе HP-Rare 1.1 (45). Матрица дистанций идентичности по состоянию (IBS, identical-by-state), используемая для проведения анализа главных компонент (principal component analysis, PCA), была построена в программе PLINK v1.07. Для создания исходных файлов и визуализации полученных данных применяли R пакет версии 3.2.3 (46). В программе STRUCTURE 2.3.4 (47) анализировали популяционную структуру со следующими настройками калькуляций: длина burn-in периода — 50000, модель марковских цепей Монте-Карло (MCMC) — 50000 повторов, 10 итераций. Расчет проводили для коэффициента k = 2 (число предполагаемых популяций). Для каждой из групп определяли среднее значение коэффициента членства Q в i-м кластере для общего числа кластеров k (Qi/k).

Результаты. Из набора STR, используемых для анализа, были исключены локусы BLT001B и CSAP36 вследствие отсутствия информации по ним у 70 % животных в группе OAM. Финальный набор STR включал 9 локусов. Первичный анализ SNP-профилей родительских форм показал наличие 45155 полиморфных SNP у романовских овец и 9816 полиморфных SNP — у архара. После фильтрации по показателям MAF, GENO, HWE были отобраны общие для обеих групп 9002 полиморфных SNP, которые дополнили 231 уникальным для каждой группы мономорфным SNP. В итоге полученный набор состоял из 9233 маркеров. В результате контроля качества, проведенного на всей выборке c применением фильтра GENO и LD-теста, были исключены соответственно 61 и 581 SNP. Финальный набор SNP, используемый для анализа, включал 8591 маркер.

Вне зависимости от типа ДНК-маркеров у ROM по сравнению с OAM была установлена более высокая степень генетического разнообразия, оцененного по Ho и Ar (табл.). Скрещивание приводило к увеличению этого показателя у гибридов F1. В обеих группах возвратных кроссов (BC1 и BC2) значения Ho, рассчитанные по STR и SNP, превышали 254

показатели у исходных родительских форм. Величина Ar, рассчитанная по SNP, в группах BC1 и BC2 снижалась по сравнению с таковой у животных F1 и принимала промежуточные значения относительно показателей у родительских форм. При использовании STR четких изменений Ar в группах BC1 и BC2 мы не выявили.

Параметры генетического разнообразия родительских и межвидовых гибридных форм рода Ovis по STR- и SNP-маркерам

Маркер	Группа	n	]        Ho        1	H e          1	F IS	1       Ar
STR	OAM	10	0,544±0,107	0,683±0,058	0,266	1,719±0,061
	ROM	35	0,656±0,040	0,775±0,028	0,154	1,778±0,147
	F 1	1	0,778			1,786±0,028
	BC 1	38	0,837±0,026	0,680±0,020	- 0,242	1,689±0,021
	BC 2	14	0,745±0,074	0,757±0,025	0,027	1,785±0,027
SNP	OAM	10	0,270±0,002	0,280±0,002	0,038	1,296±0,002
	ROM	35	0,369±0,002	0,368±0,001	- 0,004	1,458±0,005
	F 1	1	0,458			1,373±0,001
	BC 1	38	0,418±0,002	0,357±0,002	- 0,172	1,362±0,002
	BC 2	14	0,433±0,003	0,344±0,002	- 0,260	1,357±0,002

П р и м е ч а н и е. Hо — наблюдаемая гетерозиготность, Hе — ожидаемая гетерозиготность, FIS — индекс фиксации, Ar — аллельное разнообразие; значения Ho и Ar для SNP-маркеров были достоверны при p > 0,999. OAM — архары (Ovis ammon polii), ROM — овцы романовской породы (O. aries), F1 — гибридный самец от скрещивания романовской овцы и архара (50 % крови архара), BC1 и BC2 — возвратные кроссы, полученные скрещиванием ярок романовской породы с гибридными самцами F1 (25 % крови архара) и BC1 (12,5 % крови архара). Данные для F1 не приводятся, поскольку группа F1 представлена одной особью.

Сходные тенденции по STR- и SNP-маркерам отмечали при оценке динамики гетерозогот в исследуемых генерациях. Так, в группе OAM был выявлен дефицит гетерозигот — значительный по STR-маркерам (13,9 %) и небольшой по SNP-маркерам (1,0 %). Группа ROM по SNP-маркерам находилась практически в равновесии, в то время как анализ по STR показал снижение дефицита гетерозигот до 11,9 %. Оба типа маркеров указывали на избыток гетерозигот у BC1, в то время как в BC2 наблюдались обратные тенденции: дефицит гетерозигот, оцененный по STR, и увеличение избытка гетерозигот, оцененного по SNP.

Результаты анализа главных компонент (рис. 1), проведенного на основании ДНК-профилей по двум типам генетических маркеров, показали более объективную картину распределения исследуемых животных в пространстве координат согласно их происхождению при использовании SNP-маркеров. Суммарно первые две компоненты (PC1 и PC2) отвечали за 25,87 % изменчивости SNP-маркеров и лишь за 12,46 % изменчивости STR-маркеров. Третья компонента (PC3) позволяла дополнительно объяснить соответственно 6,16 и 4,45 % изменчивости.

Формирование кластеров по STR-маркерам носило нечеткий характер, были выявлены животные, локализованные в «чужом» кластере (рис. 1, А, Б). При использовании SNP-маркеров уже PC1 позволяла четко дифференцировать группы OAM, ROM, F1 и BC1 + BC2 (см. рис. 1, В). Интересным было равноудаленное положение от обеих родительских форм гибрида F1, что полностью соответствует его происхождению. PC3 позволила четко разделить возвратные кроссы BC1 и BC2 (см. рис. 1, Г).

Сравнительный анализ степени генетической дифференциации изучаемых групп по FST и DN показал четкое соответствие характера генетических связей происхождению животных при использовании SNP-маркеров: максимальные различия наблюдались между исходными видами (FST = 0,280; DN = 0,250). У гибридных особей по мере снижения кровно-сти архара наблюдалось увеличение генетических различий по отношению к архару (FST = 0,223, DN = 0,174 для BC1; FST = 0,272, DN = 0,218 для

BC2), что приближало их к домашней форме. Характер генетических связей между группами, установленный по STR-маркерам, не соответствовал происхождению животных. Возможно, это объясняется недостаточной информационной емкостью девяти STR-локусов для исследовательских работ такого направления.

Рис. 1. Результаты PCA-анализа ( principal component analysis ) по 9 STR-локусам (А, Б) и по 8591 SNP-маркерам (В, Г) в пространстве главных компонент 1 и 2 (А, В) , а также 1 и 3 (Б, Г) для родительских и межвидовых гибридных форм рода Ovis : о — OAM, архары ( Ovis ammon polii ), о — ROM, овцы романовской породы ( O. aries ), о — F 1 , гибридный самец от скрещивания романовской овцы и архара (50 % крови архара), АиV — BC 1 и BC 2 , возвратные кроссы, полученные скрещиванием ярок романовской породы с гибридными самцами F 1 (25 % крови архара) и BC 1 (12,5 % крови архара).

Наиболее эффективным на сегодняшний день методом выявления гибридов многие авторы (29, 47-49) считают кластерный анализ адмикс-моделей на основе данных по мультилокусным маркерам, реализуемый в программе STRUCTURE. В нашей работе объединение изучаемых особей в кластеры на основании STR-профилей не соответствовало их происхождению как при k = 2 (рис. 2, А), так и при k = 3 (данные не приведены). Это объясняется двумя основными причинами. Во-первых, используемые микросателлиты открыты и рекомендованы для генетического анализа домашних овец, а не архара. Во-вторых, информационной емкости девяти маркеров могло не хватить для проведения подобных исследований. Так, по расчетам J.P. Vaha и C.R. Primmer (29), для адекватного отделения возвратных кроссов от чистопородных родительских особей требуется не менее 48 локусов.

STRUCTURE анализ по 8591 отобранному SNP-маркеру показал, что формирование кластеров соответствовало фактическому происхождению индивидуумов (см. рис. 2, Б). Родительские формы (дикая и домашняя) сгруппировались в два строго консолидированных кластера. Значение членства в собственном кластере для архаров составило Q1/2 = 0,94±0,04, для романовских овец — Q2/2 = 0,99±0,01. Гибрид F1, несущий по 50 % крови дикой и домашней форм, характеризовался приблизительно равными значениями членства в каждом из двух кластеров — Q1/2 = 0,54 и 256

Q2/2 = 0,46. В поколениях возвратных кроссов происходило снижение доли членства в кластере, специфическом для OAR (Q1/2 = 0,27±0,05 в группе BC1 и Q1/2 = 0,22±0,04 в группе BC2) и увеличение доли членства в кластере, специфическом для ROM (Q2/2 = 0,73±0,05 в группе BC1 и Q2/2 = 0,78±0,04 в группе BC2).

Рис. 2. Популяционная принадлежность родительских и межвидовых гибридных форм рода Ovis на основании анализа 9 STR-локусов (А) и 8591 SNP-маркера (Б) в программе STRUCTURE при k = 2: OAM — архары ( Ovis ammon polii ), ROM — овцы романовской породы ( O. aries ), F 1 — гибридный самец от скрещивания романовской овцы и архара (50 % крови архара), BC 1 и BC 2 — возвратные кроссы, полученные скрещиванием ярок романовской породы с гибридными самцами F 1 (25 % крови архара) и BC 1 (12,5 % крови архара).

Таким образом, изменение генетического разнообразия в поколениях межвидовых гибридов вследствие влияния интрогрессии архара может быть установлено как по STR-, так и по SNP-маркерам. Тем не менее, выявлено значительное преимущество использования множественных SNP-маркеров для дифференциации гибридных животных от родительских форм. В дальнейшем планируется более детальный поиск диагностических SNP локусов, необходимых для детального изучения интрогрессии в более отдаленных от дикого родоначальника поколениях.