Выделение, культивирование и характеристика примордиальных зародышевых клеток перепелов

Получение трансгенных и химерных особей с участием примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) признано одним из перспективных направлений современной биотехнологии, которые обсуждаются как альтернатива традиционным методам селекции и модификации генома (1-5). Использование этого типа клеток в селекционных и биотехнологических программах открывает широкие возможности для направленного изменения генома и воссоздания ценных пород и линий, сохраняемых в условиях криобанков (6-12). Особенности биологии сельскохозяйственной птицы позволяют рассматривать ПЗК в качестве перспективного генетического материала. Развитие эмбрионов птиц вне организма самки значительно облегчает манипуляции, связанные с выделением ПЗК из эмбрионов-доно-

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ ¹ 16-16-04104. При проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.

ров и их трансплантацией в эмбрионы-реципиенты.

Примордиальные зародышевые клетки — это предшественники половых клеток. Они обладают свойством плюриопотентности, то есть в процессе эмбриогенеза могут дифференцироваться как в мужские, так и женские половые клетки, что значительно расширяет возможности реализации их потенциала при создании трансгенных и химерных особей с заданными свойствами. Технология получения таких особей предусматривает трансплантацию донорских клеток в гонады эмбрионов-реципиентов (13, 14). В последующем эти особи могут быть использованы как «биореакторы», которые продуцируют в половых органах зрелые донорские клетки (спермии, яйцеклетки), служащие генетическим материалом для получения потомков с заданными свойствами. При воссоздании пород и линий сельскохозяйственной птицы использование такого подхода более предпочтительно по сравнению с применением замороженно-оттаянных спермиев, поскольку дает возможность поддерживать генофондные стада за счет мужского и женского генетического материала.

Один из ключевых факторов, обеспечивающих результативность описанной технологии, — получение культуры ПЗК, максимально очищенной от других типов эмбриональных клеток. Значительная часть исследований, проводимых в этом направлении, выполнена на курах (15-20). Актуальным представляется выделение и характеристика ПЗК других видов сельскохозяйственной птицы.

В настоящем исследовании мы выделили ПЗК перепелов и дали их характеристику. Впервые было показано, что высокую чистоту культуры ПЗК перепелов обеспечивает предварительное удаление других типов клеток, в частности самой многочисленной популяции эмбриональных фибробластов. Оставшиеся в клеточной суспензии единичные фибробласты образуют фидерный слой, который обладает оптимальными свойствами для культивирования ПЗК по сравнению с другими типами фидерных слоев.

Цель работы заключалась в оптимизации приемов выделения и культивирования примордиальных зародышевых клеток перепелов в процессе поэтапной разработки технологии получения особей с заданными свойствами.

Методика. Примордиальные зародышевые клетки выделяли из 5-суточных эмбрионов перепелов ( Coturnix coturnix ) эстонской породы. Для дезагрегации эмбрионов применяли два методических подхода — механическую диссоциацию клеток и ферментативную обработку ткани.

Механическую диссоциацию клеток проводили посредством измельчения эмбрионов и последующего пипетирования в среде DМЕМ (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) в течение 5 мин.

При ферментативной обработке эмбрионов в качестве протеолитического фермента использовали раствор трипсина (0,05; 0,10; 0,15 и 0,25 %). Эмбрионы перепелов переносили в физиологический раствор, дополненный антибиотиком-антимикотиком, и измельчали. Полученную суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 200 g. К осадку добавляли подогретую до 37 ° С среду DMEM, пипетировали и для осаждения клеток центифуги-ровали. Супернатант сливали, к осадку добавляли раствор трипсина, прогретый до 37 ° С, и интенсивно пипетировали клетки в течение 5-10 мин.

Для повышения доли ПЗК в получаемой суспензии разные типы клеток разделяли по их способности к адгезии. Была поставлена серия экспериментов (в 3 повторах) с краткосрочным культивированием клеток. ПЗК идентифицировали посредством окраски на щелочную фосфатазу. На основании полученных результатов рассчитывали долю окрашен-262

ных клеток от общего числа исследованных.

В качестве ростовой среды для культивирования ПЗК использовали DMEM HG («Invitrogen», США) с содержанием глюкозы 4,5 г/л, дополненной фетальной сывороткой крови крупного рогатого скота (20 %), глутамином (2 мМ), 2-меркаптоэтанолом (10-6 мМ), LIF (leukemia inhibitory factor, 2 нг/мл), незаменимыми аминокислотами (MEM, Minimum Essential Medium, 10 мM), антибиотиком гентамицином (50 мкг/мл). Клетки снимали с субстрата с помощью 0,25 % раствора трипсина.

Для приготовления фидерных слоев клетки после достижения 90 % монослоя обрабатывали раствором митомицина С («Sigma», США) в конечной концентрации 30 мкг/мл в течение 3 ч, после чего трижды промывали раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия) и использовали для культивирования ПЗК.

Морфологическую оценку свежевыделенной популяции эмбриональных клеток перепелов проводили визуально под фазово-контрастным микроскопом («Nikon», Япония).

Для идентификации ПЗК в культуре применяли гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание. Клетки фиксировали охлажденным до - 20 ° С метанолом в течение 10 мин. Иммуногистохимическое исследование проводили с авидин-биотиновой системой («Vector Laboratories», США) (21). В качестве первых антител использовали анти-SSEA-1 (stagespecific embryonic antigen-1). Комплекс антиген-антитело идентифицировали с помощью пероксидазы, выявляемой 3,3-диаминобензидин-тетрахло-ратом (ДАБ) («Vector Laboratories», США). Для окрашивания на щелочную фосфатазу применяли кит BCIP/NBT на основе 5-бром-4-хлор-3-ин-долилфосфата и нитросинего тетразолия («Vector Laboratories», США).

Результаты. После механической диссоциации эмбрионов перепелов в образце наблюдали как отдельные разобщенные клетки, так и их группы (рис. 1, А). В результате ферментативной обработки (см. рис. 1, Б) получили клеточную суспензию, состоящую преимущественно из обособленных клеток. Клеточные агрегаты практически отсутствовали. Единичные группы клеток были выявлены только при использовании трипсина в низкой концентрации (0,05 и 0,10 %). Их доля не превышала 0,2 %.

Рис. 1. Примордиальные зародышевые клетки (ПЗК), полученные из эмбрионов перепелов ( Coturnix coturnix ) эстонской породы, при разных способах диссоциации: А — суспензия эмбриональных клеток после механической обработки эмбрионов, видны небольшие конгломераты клеток (нативный препарат); Б — суспензия эмбриональных клеток при ферментативной обработке, видны обособленные клетки (нативный препарат); В — 2-суточная культура, видны ПЗК (1), фибробласты (2), эпителиоподобные клетки (3) (нативный препарат); Г — 6-суточная культура, гистохимическое окрашивание на наличие щелочной фосфатазы, стрелкой отмечена окрашенная колония ПЗК; Д — 4-суточная культура, иммуногистохимическое окрашивание на экспрессию SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1), стрелкой отмечена окрашенная колония ПЗК; Е — 4-суточная культура, отсутствие специфического иммуногистохимического окрашивания на экспрессию SSEA-1 в контроле (без использования анти-SSEA-1), стрелкой отмечена колония ПЗК. Фазово-контрастная (А-Б) и световая (В-Е) микроскопия («Nikon», Япония), увеличение ½400.

Рис. 2. Доля живых (а) и мертвых (б) примордиальных зародышевых клеток перепелов ( Coturnix coturnix ) эстонской породы, полученных из эмбрионов при механической диссоциации и трипсинизации.

Однако выход живых клеток оказался на 4-25 % (в зависимости от концентрации раствора трипсина) меньше, чем при механической диссоциации, что было связано с токсическим действием фермента на клетки (рис. 2).

Таким образом, в варианте с применением трипсини-зации максимального выхода живых клеток (94 %) удалось добиться при использовании минимальной

протестированной концентрации этого фермента (0,05 %), что позволяет рассматривать ее как оптимальную для получения обособленных эмбриональных клеток перепелов при сохранении высокой жизнеспособности клеточной суспензии.

Суспензию эмбриональных клеток, полученную в результате ферментативной обработки эмбрионов перепелов, высевали на культуральные чашки. В начале культивирования (1 ч) происходило прикрепление к пластику значительной части эмбриональных фибробластов. Через 24 ч эти клетки распластывались и начинали делиться. Основная часть ПЗК, которые имели вид округлых образований, находилась во взвешенном состоянии, и только некоторые прикреплялись к распластавшимся эмбриональным фибробластам, используя их в качестве фидерного слоя. На 1-е сут (см. рис., В) ПЗК прикреплялись к фидерному слою и приобретали шарообразную форму.

В полученной клеточной популяции было выявлено несколько типов клеток. Многочисленную группу составляли эмбриональные фибробласты, эпителиоподобные клетки и ПЗК. ПЗК характеризовались округ- лой формой, эпителиоподобные клетки имели неправильную форму и крупное ядро, фибробласты — веретенообразную форму (см. рис., В).

Для максимальной очистки популяции ПЗК использовали метод, основанный на неодинаковых адгезивных способностях разных типов клеток. Первичную культуру эмбриональных клеток перепелов культивировали в течение 1 ч, после чего отбирали супернатант с неприкрепивши-мися клетками, переносили в новые чашки Петри и продолжали культивирование. Эмбриональные фибробласты, присутствовавшие в суспензии после сбора культуральной среды, служили фидерным слоем, на который прикреплялись ПЗК. Через 1 ч вновь отбирали супернанант для дальнейшего культивирования. После 3-кратного отбора супернатанта долю ПЗК в суспензии удалось повысить до 79 %.

Выделенные ПЗК перепелов высевали на фидерные слои, которыми служили клетки линии STO (перевиваемые эмбриональные фибробласты мыши ), первичные эмбриональные фибробласты перепелов, эмбриональные фибробласты кур, или на чашки, покрытые 0,2 % желатином. Наилучшие результаты были получены при использовании первичных эмбриональных фибробластов перепелов (табл.).

Эффективность культивирования примордиальных зародышевых клеток (ПКЗ) перепелов ( Coturnix coturnix ) в зависимости от фидерного слоя
Фидерный слой	Прикрепление к фидерному слою	Образование колоний
Клеточная линия STO	На 1-2-е сут	На 4-5-е сут
Эмбриональные фибробласты кур	На 1-2-е сут	На 4-е сут
Первичные эмбриональные фибробласты перепелов	На 1-2-е сут	На 3-и сут
П р и м еч а ни е. STO — клеточная линия перевиваемых эмбриональных фибробластов мыши.

На 3-и-4-е сут в культуре формировались колонии ПЗК, наличие которых было подтверждено экспрессией в этих клетках маркеров стволовых клеток — щелочной фосфатазы (см. рис., Г) и белка SSEA-1 (см. рис., Д, Е).

Итак, у перепелов эффективность получения максимально однородной культуры первичных зародышевых клеток (ПЗК) зависит от метода их отделения от других клеток и используемого фидерного слоя. Разделение клеток по способности к адгезии позволяет максимально очистить культуру ПЗК от остальных клеток, в частности от эмбриональных фибробластов. Единичные эмбриональные фибробласты, оставшиеся после этого в клеточной суспензии, при последующем культивировании служат фидерным слоем, на который прикрепляются ПЗК. Культивирование ПЗК на фидерных слоях с использованием соответствующей ростовой среды позволяет получать колонии ПЗК на 3-и-4-е сут. Оптимальный фидерный слой для культивирования ПЗК перепелов формируется из собственных эмбриональных фибробластов.