Криопротекторы. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Длительное сохранение на уровне клетки воспроизводительных качеств животного необходимо для современной селекции, в том числе с применением экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). За последние годы достигнуты значительные успехи в разработке методов подготовки спермы животных для оплодотворения яйцеклетки in vitro. Основная цель таких методик - получить популяцию подвижных спермиев с подходящей морфологией и способностью к оплодотворению ооцита in vivo или in vitro. Однако эти приемы не всегда эффективны в силу особенностей подготовки клеток и отсутствия стандартов проведения процедуры. Нами предложена модифицированная среда для экстракорпорального оплодотворения, адаптированная для культивирования спермиев барана. Сперму баранов северокавказской породы (возраст - 2-3 года) получали согласно принятым стандартам и инструкциям. Отобранные образцы оценивали органолептически и при микроскопировании, дальнейшую подготовку проводили по методике-прототипу, описанной в статье A.P. Gandhi (2000), и по разработанной нами методике, согласно которой сперма вносится в глюкозо-цитратно-желточный разбавитель (ГЦЖ), после чего переносится в среду SOF wash, приготовленную без глюкозы и глютамина с добавлением бычьего сывороточного альбумина (6 мг/мл), кофеина (0,2 мг/мл) и гепарина (50 мкг/мл). Установлено, что предложенная нами модифицированная методика, используемая для дозревания спермиев, позволяет повысить их активность на 1,3 балла по сравнению с существующей технологией, при этом число живых спермиев увеличивается на 43,7 %, их жизнеспособность возрастает в 1,6 раза, а доля спермиев с прямолинейно-поступательным движением - в 1,6 раза. Таким образом, разработанная нами методика культивирования сперматозоидов барана, предназначенных для ЭКО, значительно улучшает качественные и количественные характеристики образцов, что позволяет рекомендовать ее применение в лабораториях вспомогательных репродуктивных технологий при подготовке спермы животных к оплодотворению in vitro.
Бесплатно
Статья научная
Один из подходов к решению практических проблем криоконсервации клеток заключается в повышении устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур. Мы изучили влияние производных бензимидазола этил-1-бензимидазол-2-ил-сульфанила, 2-этилсуль-фанилбензимидазол-1-ила и 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в концентрациях 10-3, 10-5, 10-11, 10-13, 10-15 М на сохранность сперматозоидов при замораживании и оттаивании, на их устойчивость к холодовому шоку и изменению осмотического давления. Установлено, что изученные вещества повышали живучесть бычьих сперматозоидов при хранении в лактозо-цит-ратной среде. При этом наибольшую активность и сохранность отмечали при введении в среду для замораживания спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10-13-10-15 М. Время переживания сперматозоидов до сохранения подвижности у 10 % клеток повышалось по сравнению с контролем на 73 %. Аналогичные результаты получили при замораживании-оттаивании спермы жеребцов в присутствии 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в концентрации 10-13 М: доля подвижных неповрежденных клеток после замораживания-оттаи-вания оказалась на 15,2±3,49 млн/мл (Р
Бесплатно
Статья научная
В настоящее время для криоконсервации семени сельскохозяйственных животных актуальной задачей остается разработка сред на основе растительных фосфолипидов, не содержащих компонентов животного происхождения. Однако в комплексе растительных липидов, в отличие от желточных, отсутствует холестерин, который играет важную роль в обеспечении криорезистентности. Известно, что обогащение клеточных мембран холестерином усиливает толерантность сперматозоидов быка к охлаждению и замораживанию (E. Mocé с соавт., 2010; E. Mocé с соавт., 2014; M.H. Fayyaz с соавт., 2016). Можно предположить, что включение холестерина в состав безжелточных сред на основе растительных лецитинов способно повысить их криозащитную эффективность. Нами впервые одновременно оценено влияние холестерина на свойства липосом или липидных частиц на основе смеси соевых фосфолипидов и на их криозащитное действие при добавлении в растворы для криоконсервации спермы быка. Цель исследования - определить, как введение холестерина в комплекс растительных липидов повлияет на физические характристики и криопротекторную функцию липидной суспензии. Для этого мы изучили динамический размер липосом и липидных частиц из обработанной ультразвуком смеси холестерина с соевым лецитином (диапазон массовой доли холестерина - 0; 8; 18; 33 и 50 %) и определили выживаемость сперматозоидов быка при замораживании и оттаивании в среде, содержащей такие липидные смеси. О жизнеспособности половых клеток судили по доле сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением (при скорости более 25 мкм/с) сразу после оттаивания и через 5 ч инкубации при 38 °С. Для приготовления суспензии использовали коммерческий лецитин марки LeciPRO 90 («Unitechem Co., Ltd», КНР) и очищенный холестерин, полученный из ланолина («Sigma-Aldrich Co.», США), для озвучивания - ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т («НПП Академприбор», Россия; 22 кГц, 60 Вт/см2, 5 мин). Показано, что введение холестерина в состав липосом из коммерческого соевого лецитина LeciPRO 90 в концентрации 18 и 33 % по массе липидов увеличивало размер липосом после ультразвукового дробления. Такие смеси формировали монодисперсную суспензию со средним размером частиц соответственно 66±6 нм и 62±11 нм. Введение холестерина в концентрации 50 % приводило к полному изменению состояния липидной суспензии с образованием сложных структур из фосфолипидно-холестериновых ламелл и кристаллов монгидрата холестерина. В концентрации 8 % холестерин не повышал криозащитную эффективность лецитина, а при 18-50 % она снижалась. При увеличении концентрации холестерина в липидной смеси до 50 % (» 66 моль%) отмечалось некоторое повышение подвижности сперматозоидов относительно минимального значения в варианте с 33 % холестерина. Наиболее вероятная причина негативного воздействия холестерина на криозащитную эффективность липидной суспензии - ухудшение взаимодействия липосом с цитоплазматической мембраной сперматозоида за счет уплотнения упаковки фосфолипидов в липидном бислое.
Бесплатно
