Сверхмалые концентрации производных бензимидазола повышают устойчивость сперматозоидов быков и жеребцов при криоконсервации и действии вредных факторов

Автор: Никиткина Е.В., Шапиев И.Ш., Племяшов К.В., Харитонов С.А.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Статья в выпуске: 2 т.52, 2017 года.

Бесплатный доступ

Один из подходов к решению практических проблем криоконсервации клеток заключается в повышении устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур. Мы изучили влияние производных бензимидазола этил-1-бензимидазол-2-ил-сульфанила, 2-этилсуль-фанилбензимидазол-1-ила и 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в концентрациях 10-3, 10-5, 10-11, 10-13, 10-15 М на сохранность сперматозоидов при замораживании и оттаивании, на их устойчивость к холодовому шоку и изменению осмотического давления. Установлено, что изученные вещества повышали живучесть бычьих сперматозоидов при хранении в лактозо-цит-ратной среде. При этом наибольшую активность и сохранность отмечали при введении в среду для замораживания спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10-13-10-15 М. Время переживания сперматозоидов до сохранения подвижности у 10 % клеток повышалось по сравнению с контролем на 73 %. Аналогичные результаты получили при замораживании-оттаивании спермы жеребцов в присутствии 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в концентрации 10-13 М: доля подвижных неповрежденных клеток после замораживания-оттаи-вания оказалась на 15,2±3,49 млн/мл (Р

Еще

Сперма, замораживание, бензимидазол, сверхмалыe концентрации, мембраны клеток, митохондрии, быки, жеребцы

Короткий адрес: https://sciup.org/142214028

IDR: 142214028 | DOI: 10.15389/agrobiology.2017.2.298rus

Текст научной статьи Сверхмалые концентрации производных бензимидазола повышают устойчивость сперматозоидов быков и жеребцов при криоконсервации и действии вредных факторов

Несмотря на широкое применение криоконсервированной спермы при разведении разных видов сельскохозяйственных животных, гибель до 40-50 % половых клеток после замораживания остается проблемой для практики искусственного осеменения, поэтому поиск способов сделать сперматозоиды устойчивее к повреждающему действию низких температур все еще актуален (1-5).

Неспецифическое повышение устойчивости клеток под воздействием химических веществ разной природы в подпороговых дозах и в концентрациях, на несколько порядков ниже субтоксических, описано давно. В отечественной литературе к ранним публикация по этой теме относятся исследования, подтвердившие увеличение времени переживания сперматозоидов под влиянием подпороговых доз ряда агентов — наркотиков, мочевины, ингибиторов обмена и др. (6-11). Позднее были обнару-298

жены вещества, обладающие способностью вызывать повышение резистентности клеток в концентрациях на несколько порядков ниже субтоксических. Так, показано, что бензимидазол и его производное дибазол в концентрациях 10 - 3 -10 ^- ¹¹ М способствует росту устойчивости клеток и тканей к повреждающему воздействию низких и высоких температур (12-14).

В последние 20 лет внимание исследователей привлекает феномен эффективности сверхмалых доз (СМД, 10 ^- ¹²-10 ^- ¹⁵ М) веществ в отношении биологических объектов. В первую очередь, причина в том, что многие соединения в СМД могут вызывать ответные реакции, сопоставимые и даже более значительные, чем при существенно более высоких концентрациях (15, 16). Попытки объяснить механизм биологического действия физических и химических факторов в СМД (17-21) к настоящему времени не привели к единому мнению. Тем не менее, СМД в ряде случаев нашли успешное применение в медицине (22-24) и ветеринарии (25, 26).

Нами впервые изучено влияние производных бензимидазола на устойчивость сперматозоидов быков и жеребцов к повреждающему действию низких и ультранизких температур при криоконсервации и показано, что наибольшую активность и сохранность отмечали при введении в среду для замораживания спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10 ^- ¹ 3 -10 ^- ¹⁵ М.

Цель работы — исследование влияния низких и сверхнизких концентраций производных бензимидазола на живучесть сперматозоидов при разбавлении, замораживании и оттаивании, их устойчивость при холодовом шоке и в средах с разной осмолярностью.

Методика . Производные бензимидазола были синтезированы на кафедре органической химии Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. Используемые концентрации анализируемых веществ в разбавителе — 10 - 3 , 10 ^- ⁵, 10 ^- ¹¹, 10 ^- ¹³, 10 ^- ¹⁵ М.

В опытах использовали сперму быков ( n = 11) черно-пестрой породы Ленинградского типа (ФГУП «Невское», Ленинградская обл.) и лошадей ( n = 10) тракененской, ганноверской, арабской и голштинской пород (ООО «Ковбой», фермерское хозяйство Маланичевых и частные владельцы, Ленинградская обл.). Сперма быков имела начальную подвижность 5-6 баллов (по этому показателю образцы не были допущены к замораживанию для производственных целей; при измерении скорости дыхания использовали образцы с большей подвижностью), жеребцов — 7-8 баллов. Для сравнения вариантов опыта каждый эякулят делили на равные части.

При определении устойчивости сперматозоидов быков к изменению осмотического давления и холодовому шоку в качестве разбавителя применяли водный раствор лактозы. Контролем был раствор с осмолярностью 336 мосм/л, содержащий 11,5 г лактозы на 100 мл воды; для повышения или снижения осмолярности в ряду 246, 276, 306, 336 и 366 мосм/л это количество лактозы увеличивали или уменьшали (на каждые 30 мосм/л — по 1,02 г). Процедура замораживания образцов соответствовала межгосударственному стандарту ГОСТ 26030-2015 (27). Холодовой шок сперматозоидов быков вызывали снижением температуры разбавленной спермы от 20 до 4 ° С в течение 2 мин.

Сперму жеребцов разбавляли в среде Kenney (49 г D-глюкозы, 24 г сухого молока, 40 мг гентамицина, 1 л дистиллированной воды) в объемном соотношении 1:3, затем центрифугировали 8 мин при 600 g. Осадок сперматозоидов суспендировали в среде Kenney и разбавляли до плотности 100 млн кл/мл, сперму расфасовывали в соломинки по 0,5 мл, охлаждали 299

при 4 ° С 90 мин и замораживали в парах жидкого азота 12 мин при температуре 110 ° С, после чего опускали в жидкий азот. Оттаивали сперму жеребцов при 37 ° С 1-2 мин.

Объем, количество и подвижность сперматозоидов (полное отсутствие — 0 баллов, 100 % — 10 баллов) оценивали общепринятыми методами, морфологию и состояние акросомного чехлика — при фазово-контрастной световой микроскопии. Время переживания спермы быков выражали в часах до сохранности 10 % подвижных клеток и до полной потери подвижности.

Дыхательную активность клеток определяли согласно описанию (28) на полярографе LP 7 (Чехия) с платиновым электродом Кларка. Инкубационной средой служила 6 % глюкоза, в которую последовательно добавляли (в расчете на конечную концентрацию) сперму (50-100 млн спрематозоидов на 1 мл), сукцинат калия в качестве субстрата (1,0*10 ^- ³-2,5*10 — 3 М), классический разобщитель дыхания и фосфорилирования про-тонофор 2,4-динитрофенол (ДНФ, 2,5*10 ^- ⁵ М).

Поврежденность плазматических мембран сперматозоидов жеребцов оценивали с помощью красителя Sperm VitalStain («Nidacon International AB», Швеция). Окрашивание проводили в пробирках типа Eppendorf (50 мкл спермы смешивали с 50 мкл красителя) и делали мазки на предметных стеклах. Препараты просматривали при увлечении ½100 (объектив) с масляной иммерсией, подсчитывая не менее 200 клеток в каждом образце (белые клетки — неповрежденные, красные или розовые — сперматозоиды с поврежденными мембранами).

Для микроскопирования использовали визуализирующую систему Axio Imager («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия»).

Данные обрабатывали в программах SigmaPlot 12.5 («Systat Software Inc.», США) и Micrisoft Excel. Выполняли общий статистический анализ и оценку средней разницы между выборками с попарно связанными вариантами. Различия считали статистически значимыми при P < 0,05. В таблицах приведены значения средних ( Х ) и стандартной ошибки среднего ( õ ).

Результаты . Один из возможных подходов к практическому решению проблемы сохранности криоконсервированных сперматозоидов — изыскание способов повышения их устойчивости к повреждающему эффекту низких температур. К настоящему времени накоплено достаточно данных о влиянии охлаждения на клетки (29, 30), которые позволяют сделать определенные выводы о механизмах повреждения и подходах к предотвращению этих повреждений. Можно выделить два типа повреждений клеточных структур, возникающих при действии холода: связанные с охлаждением до начала замерзания и возникающие в результате кристаллообразования при замораживании. Среди факторов, влияющих на выживаемость клеток и тканей при криоконсервации, выделяют холодовой шок (31) и изменения осмотического давления при разбавлении, замораживании и оттаивании спермы.

При сравнении времени переживания сперматозоидов быков при температуре 20 ° С в присутствии в среде для разбавления трех производных бензимидазола в концентрациях 10 — 3 -10 ^- ¹⁵ М было установлено, что живучесть сперматозоидов быков при хранении в лактозо-цитратной среде повышалась. Наибольший положительный эффект дали этил-1-бензимида-зол-2-ил-сульфанил в концентрации 10 ^- ⁵ М (превышение на 46 %), 2-этил-сульфанилбензимидазол-1-ил в концентрации 10 ^- ¹¹ М (на 59 %) и 2-бен-зимидазол-1-ил-1-уксусная кислота в концентрациях 10 ^- ¹¹ М, 10 ^- ¹³ М и 300

10 - 15 М (на 88-90 %).

Сравнение действия наиболее эффективных концентраций изученных производных при повышенной плюсовой температуре (40 ° С) (табл. 1) показало, что наибольшую активность и живучесть сперматозоидов быков после замораживания-оттаивания обеспечивало присутствие в среде для разбавления спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизких концентрациях 10 ^- ¹³-10 ^- ¹⁵ М, при которых на один сперматозоид приходилось всего 4-6 молекул исследуемого вещества. В этом варианте доля выживших сперматозоидов (активность) была на 8-13 % достоверно больше (Р < 0,01), чем в контроле. Время переживания до сохранения подвижности 10 % сперматозоидов увеличивалось на 73 %, до полного прекращения подвижности — превышало контроль на 85-90 %.

1. Переживаемость бычьих сперматозоидов при 40 ° С после замораживания и оттаивания в среде с производными бензимидазола в сверхмалых концентрациях ( n = 7, Х ± õ )

Вариант	Активность после размораживания, балл	Время переживания, ч
Вариант	Активность после размораживания, балл	до 1 балла (10 %) до 0 баллов
Контроль Производное бензимидазола, M:	2,6±0,28	1,5±0,18	2,0±0,19
этил-1-бензимидазол-2-ил-сульфанил, 10 ^- ⁵	3,2±0,01	2,3±0,22*	2,9±0,21**
2-этилсульфанилбензимидазол- 1-ил, 10 ^- ¹¹	3,0±0,23	2,0±0,23	3,2±0,18**
2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота, 10 ^- ¹¹	3,2±0,38**	2,0±0,21	2,9±0,24**
2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота, 10 ^- ¹³	3,9±0,26***	2,6±0,21***	3,7±0,21***
2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота, 10 ^- ¹⁵	3,4±0,07***	2,6±0,09***	3,8±0,15***

П р и м е ч а н и е. Использована сперма быков с исходной активностью 5-6 баллов.

*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при P < 0,01.

Аналогичные результаты получили при замораживании и оттаивании спермы жеребцов в среде с 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислотой в концентрации 10 ^- ¹³ М: число подвижных неповрежденных клеток оказалось больше на 15,2±3,49 млн/мл (Р < 0,01), чем в среде без добавки, выживаемость сперматозоидов после замораживания-оттаивания повысилась на 8,1 % (Р < 0,01), сохранность акросом — на 1,9±0,63 % (Р < 0,05).

2. Сохранность бычьих сперматозоидов под влиянием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты (10 ^- ¹³ М) при температуре 40 ° С в среде с разной осмолярностью ( n = 11, Х ± õ )

Осмолярность среды, мосм/л	Подвижных клеток, %
	после разбавления		через 1 ч при 40 ° С		через 2 ч при 40 ° С
	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль	опыт
366	28±4,8^а	42±5,8^а	10±0,9^g	14±1,6^g	0	0
336	60±3,2^A	60±3,2^B	29±3,7^d	41±3,3^d	11ⁱ±2,4	26ⁱ±3,0
306	24±2,4^b	40±4,4^b	11±1,6^e	19±2,7^e	0	6±1,6
276	15±2,2^c	31±4,0^c	0	12±1,5	0	0
246	4±2,4*	20±3,2*	0	6±1,8	0	0
П р и м е ч а н и е.	Использована сперма быков с исходной активностью 5-6 баллов.

* Различия в вариантах aa, bb, cc, dd, ee, ii, Aa, Ab, Bb и Ba статистически значимы при Р < 0,01, в gg — при P < 0,05.

2-Бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота в той же концентрации 10—13 М положительно влияла и на устойчивость бычьих сперматозоидов при изменении осмолярности среды для разбавления (табл. 2). Сразу после разбавления при комнатной температуре (20 °С) в изотонической для бычьих сперматозоидов осмолярности (336 мосм/л) 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота не влияла на активность клеток по сравнению с контрольной. Однако через 1 и 2 ч после хранения (при 40 °С) в присутствии добавки подвижность сперматозоидов в изотонической среде оказалась выше соответственно на 12 и 15 % (P < 0,01), чем в контроле. При уменьшении или увеличении осмолярности среды относительно изотонической на 30 мосм/л доля подвижных клеток в сперме снижалась сразу при разбавлении (см. табл. 2), однако в среде с 2-бензимидазол-1-ил-1-уксус-ной кислотой (10-13 М) — только на 18-20 %, тогда как в контроле — на 32-36 %. В гипоосмотических условиях через 1 ч в контроле наблюдали полную гибель сперматозоидов, а в опыте 6-12 % клеток сохраняли подвижность. В гиперосмотических условиях (366 мосм/л) через 1 ч доля подвижных сперматозоидов в опыте была достоверно выше по сравнению с контролем — на 14 % (P < 0,05).

Фазово-контрастная микроскопия не выявила морфологических различий в структуре акросомы и жгутика сперматозоидов между опытным и контрольным вариантами сразу после разбавления спермы, тогда как разная осмолярность среды приводила к изменению сохранности и живучести сперматозоидов (см. табл. 2). После холодового шока в контрольной среде 40 % сперматозоидов утратили двигательную активность, в то время как в варианте с 10 ^- ¹³ М 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислотой подвижность сперматозоидов уменьшилась на 26 %. Можно предположить, что наблюдаемое повышение устойчивости клеток к осмотическим воздействиям и холодовому шоку связано с защитным эффектом, который оказывают исследованные производные бензимидазола на мембранные структуры сперматозоидов.

Как известно, подвижность и время переживания сперматозоидов зависят от работы системы энергообеспечения — дыхания и фосфорилирования и напрямую связаны с функциональным состоянием митохондрий. Мембраны митохондрий наиболее чувствительны к действию повреждающих факторов (28). Сукцинат усиливает клеточное дыхание, проникая только через поврежденную плазматическую мембрану, а динитрофенол служит разобщителем тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования (28). В наших опытах (табл. 3) стимуляция дыхания бычьих сперматозоидов сукцинатом после замораживания и оттаивания в присутствии 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты (10 ^- ¹³ М) была ниже, а ДНФ — выше, чем в контроле, что указывает на лучшую сохранность функции энергетического аппарата при использовании добавки. Этим подтверждается предположение, что сверхмалые концентрации (дозы) исследованных производных бензимидазола способствуют повышению устойчивости мембранных структур сперматозоидов к действию сверхнизкой температуры.

3. Изменение скорости дыхания у бычьих сперматозоидов под влиянием 2-бен-зимидаз о л-1-ил-1-уксусной кислоты (10 ^- ¹³ М) при замораживании и оттаивании ( Х ± õ )

Сперма	Активность, балл	Дыхание, нмоль О 2/ мин
		скорость	стимуляция
		скорость	сукцинанатом К 1	ДНФ
Свежеразбавленная После замораживания и оттаивания:	7,0-8,0	130,0±1,56	1,06±0,012	2,20±0,050
контроль	4,0-5,0	77,0±3,82	2,03±0,187	1,57±0,029
опыт	4,5-6,0	88,0±5,03	1,47±0,730*	1,84±0,021*

Прим еч ани е. ДНФ — 2,4-динитрофенол.

* Различия с контролем статистически значимы при P < 0,01.

Известно, что при охлаждении и замораживании сперматозоидов происходит выход ионов K+ в среду, что отрицательно сказывается на живучести клеток (31). Производные бензимидазола служат ингибиторами Н+/К+-АТФазы плазматической мембраны и предотвращают избыточный выход K+. По-видимому, взаимодействуя с рецептором на внешней мембране сперматозоида, производные бензимидазола вызывают каскадную пе-302

рестройку мембранных структур клетки. Одновременно изменяется вязкость воды вследствие возникновения водородных связей между молекулами с образованием кластеров. В результате может повышаться устойчивость мембранных структур к повреждающему действию колебаний осмотического давления, происходящих при замораживании и оттаивании. Кроме того, возможно, при замерзании воды изменяется характер кристаллообразования в сторону уменьшения размера кристаллов, что снижает их повреждающее влияние. Отсутствие выраженного действия изученных веществ в промежуточных концентрациях согласуется с классической теорией свободных рецепторов R.P. Stephenson (32-34), согласно которой максимальный эффект достигается при связывании лиганда только с небольшой частью рецепторов.

Итак, при введении 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10 ^- ¹ 3 -10 ^- ¹⁵ М в среду для замораживания спермы быков и жеребцов отмечали наибольшую активность и сохранность сперматозоидов (по времени переживания и доле сохраняющих подвижность клеток) после замораживания и оттаивания, холодового шока при изменении осмолярности и повышенной температуре (40 ° С). Динитрофенол практически одинаково усиливал клеточное дыхание в опыте и в контроле, тогда как сукцинат, который проникает через поврежденные мембраны, оказывал меньшее стимулирующее влияние в присутствии 2-бензи-мидазол-1-ил-1-уксусной кислоты. Наблюдаемый эффект предположительно связан с защитным действием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты на плазматическую мембрану и мембранные структуры митохондрий сперматозоидов вследствие взаимодействия молекулы исследуемого вещества с рецептором на внешней мембране, а также с возможным влиянием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты на состояние молекул воды, ассоциированных с мембранными белками.

Список литературы Сверхмалые концентрации производных бензимидазола повышают устойчивость сперматозоидов быков и жеребцов при криоконсервации и действии вредных факторов

Науменкова В.А., Брагина Е.Е., Никиткина Е.В. Устойчивость спермы жеребцов к замораживанию под влиянием антиоксиданта SkQ1. Сельскохозяйственная биология, 2012, 2: 64-68 ( ) DOI: 10.15389/agrobiology.2012.2.64rus
Джамалдинов А.Ч., Нарижный А.Г., Крейндлина Н.И., Курипко А.Н. Джамалдинов А.Ч. Способы повышения криоустойчивости спермы хряков-производителей. Достижения науки и техники АПК, 2012, 8: 69-70.
Епишина Т.М. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на криорезистентность семени баранов. Ветеринарная патология, 2009, 2: 32-33
Chaveiro A., Liu J., Mullen S., Woelders H., Critser J.K. Determination of bull sperm membrane permeability to water and cryoprotectants using a concentration-depen-dent self-quenching fluorophore. Cryobiology, 2004, 48: 72-80.
Chaveiro A., Machado L., Frijters A., Engel B., Woelders H. Improvement of parameters of freezing medium and freezing protocol for bull sperm using two osmotic supports. Theriogenology, 2006, 65(9): 1875-1890 ( ) DOI: 10.1016/j.theriogenology.2005.10.017
Александров В.Я. Проблема авторегуляции в цитологии. Реактивное повышение устойчивости клеток к действию повреждающих агентов (альтерации). Цитология, 1965, 7(4): 10-15.
Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Наук В.А. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. Л., 1988.
Amirat-Briand L., Bencharif D., Vera-Munoz O., Bel Hadj Ali H., Destrumelle S., Desherces S., Schmidt E., Anton M., Tainturier D. Effect of glutamine on post-thaw motility of bull spermatozoa after association with LDL (low density lipoproteins) extender: Preliminary results. Theriogenology, 2009, 71(8): 1209-1214 ( ) DOI: 10.1016/j.theriogenology.2008.10.002
El-sheshtawy R.I., El-Nattat W.S., Sabra H.A. Effect of addition of catalase with or without L-tryptophan on cryopreservation of bull extended semen and conception rate. Global Veterinaria, 2013, 11(3): 280-284 ( ) DOI: 10.5829/idosi/gv.2013.11.3.7612
Muino R., Pena A.I., Rodrıguez A., Tamargo C., Hidalgo C.O. Effects of cryopreservation on the motile sperm subpopulations in semen from Asturiana de los Valles bulls. Theriogenology, 2009, 72(6): 860-868 ( ) DOI: 10.1016/j.theriogenology.2009.06.009
Serhat Büyükleblebici, Pürhan Barbaros Tuncerb, Mustafa Numan Bucak, Ayse Ekend, Serpil Sarıözkan, Umut Tasdemir, Burcu Ün-lü Endirlik. Cryopreservation of bull sperm: Effects of extender supplemented with different cryoprotectants andantioxidants on sperm motility, antioxidant capacity and fertility results. Anim. Reprod. Sci., 2014, 150(3-4): 77-83 ( ) DOI: 10.1016/j.anireprosci.2014.09.006
Сидоров О.А. Влияние дибазола на время переживания сперматозоидов. Мат. науч. совещания по вопросам фармакологической регуляции клеточной резистентности. Л., 1963: 18-20.
Андреева Е.Н. Влияние дибазола, а также некоторых стимуляторов и ингибиторов белкового синтеза на теплоустойчивость портняжной мышцы лягушки. В сб.: Синтез белка и резистентность клеток. Л., 1971: 36-40.
Русин В.Я. Влияние дибазола на устойчивость клеток к повреждению. В сб.: Синтез белка и резистентность клеток. Л., 1971: 58-61.
Бурлакова Е.Б. Эффект сверхмалых доз. Вести РАН, 1994, 64(5): 425.
Черетаев И.В., Коренюк И.И., Гамма Т.В., Хусаинов Д.Р. Влияние сверхмалых концентраций бензимидазола на поведение крыс в тесте Порсолта в норме и на фоне активации дофаминергической системы юмексом. Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия Биология, химия, 2014, 27/66(4): 93-99.
Бурлакова Е.Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности. Российский химический журнал, 1999, 43(5): 3-11.
Ямскова В.П., Краснов М.С., Мальцев Д.И., Куликова О.Г., Рыбакова Е.Ю., Богданов В.В., Ямсков И.А. К вопросу о механизме биологического действия сверхмалых доз. Мат. VI Межд. конгр. «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб, 2012: 98. Режим доступа: http://www.biophys.ru/archive/congress2012/proc-p98-d.pdf. Без даты.
Boldyreva L.B., Boldyreva E.M. The model of superfluid physical vacuum as a basis for explanation of efficacy of highly diluted homeopathic remedies. Journal of Homeopathy & Ayurvedic Medicine, 2012, 1(2): 2-6 ( ) DOI: 10.4172/2167-1206.1000109
Denisov Yu.D. To question on the proof parareceptor mechanism of action of ultra-low doses xenobiotics. EurAsian Journal of BioMedicine, 2011(4): 17-20.
Koreniuk I.I., Gamma T.V., Katiushyna O.V., Epishkin I.V., Khusainov D.R., Shylina V.V., Cheretaev I.V., Kolotilova O.I. Effect of concentration ultralow 1,5-benzodiazepinona-2 on the pain threshold in rats intoxicated with their organism cadmium chloride. European Journal of Natural History, 2013, 1: 16.
Ezz H.A.A., Elkala R.S. Ultra-low-dose naloxone added to fentanyl and lidocaine for peribulbar anesthesia: A randomized controlled trial. Egyptian Journal of Anaesthesia, 2015, 3: 161-165.
Yovell Y., Bar G., Mashiah M., Baruch Y., Briskman I., Asherov J., Lotan A., Rigbi A., Panksepp J. Ultra-low dose buprenorphine as a time-limited treatment for severe suicidal ideation: a randomized controlled trial. The Am. J. Psychiat., 2016, 173(5): 491-498 ( ) DOI: 10.1176/appi.ajp.2015.15040535
Doutremepuich С., Aguejouf O., Belon P. Effects of ultra-low-dose aspirin on embolization in a model of laser-induced thrombus formation. Semin. Thromb. Hemost., 1996, 22(S1): 67-70.
Doutremepuich C., Aguejouf O., Desplat V., Eizayaga F.X. Paradoxical thrombotic effects of aspirin: experimental study on 1000 animals. Cardiovascular & Hematological Disorders-Drug Targets, 2010, 10(2):103-110 ( ) DOI: 10.2174/187152910791292510
Славецкая М.Б., Капай Н.А. Сверхмалые дозы биологически активных веществ как основа лекарственных препаратов. М., 2011.
Сперма быков замороженная. ГОСТ 26030-2015. М., 2015.
Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш., Корбан Н.В. Способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных. А.С. 938990 (РФ). Всероссийский НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных (РФ) ¹ 293645. Заявл. 09.06.1980. Опубл. 30.06.82, Бюл. ¹ 24.
Белоус А.М., Бондаренко В.А., Гулевский А.К. Молекулярно-клеточная концепция криоповреждения клетки: роль трансмембранных дефектов. Криобиология, 1987, 2: 3-10
Wolfw J., Bryant G. Cryobiology and anhydrobiology of cells. Sydney, 2004.
Кононов В.П., Мамбеталиев М.С., Турбин В.Ф. Трансмембранные перемещения ионов К, Nа, Са в сперматозоидах быков как показатели их биологической полноценности. Сельскохозяйственная биология, 1993, 4: 47-52.
Stephenson R.P. A modification of receptor theory. Brit. J. Pharmacol., 1956, 11: 379-393.
Зайцев С.В., Ефанов А.М., Сазанов Л.А. Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах. Российский химический журнал, 1999, 5(43): 28-33.
Торчинский А.А., Жерновков В.Е. Модификация структурного состояния глубоко лежащих слоев липидов мембран эндоплазматического ретикулума in vitro и in vivo ультранизкими концентрациями тиролиберина. Мат. I Ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН «Биохимическая физика». М., 2001: 12-30.

Еще

Статья научная