Сверхмалые концентрации производных бензимидазола повышают устойчивость сперматозоидов быков и жеребцов при криоконсервации и действии вредных факторов

Несмотря на широкое применение криоконсервированной спермы при разведении разных видов сельскохозяйственных животных, гибель до 40-50 % половых клеток после замораживания остается проблемой для практики искусственного осеменения, поэтому поиск способов сделать сперматозоиды устойчивее к повреждающему действию низких температур все еще актуален (1-5).

Неспецифическое повышение устойчивости клеток под воздействием химических веществ разной природы в подпороговых дозах и в концентрациях, на несколько порядков ниже субтоксических, описано давно. В отечественной литературе к ранним публикация по этой теме относятся исследования, подтвердившие увеличение времени переживания сперматозоидов под влиянием подпороговых доз ряда агентов — наркотиков, мочевины, ингибиторов обмена и др. (6-11). Позднее были обнару-298

жены вещества, обладающие способностью вызывать повышение резистентности клеток в концентрациях на несколько порядков ниже субтоксических. Так, показано, что бензимидазол и его производное дибазол в концентрациях 10 - 3 -10 ^{- 11} М способствует росту устойчивости клеток и тканей к повреждающему воздействию низких и высоких температур (12-14).

В последние 20 лет внимание исследователей привлекает феномен эффективности сверхмалых доз (СМД, 10 ^{- 12}-10 ^{- 15} М) веществ в отношении биологических объектов. В первую очередь, причина в том, что многие соединения в СМД могут вызывать ответные реакции, сопоставимые и даже более значительные, чем при существенно более высоких концентрациях (15, 16). Попытки объяснить механизм биологического действия физических и химических факторов в СМД (17-21) к настоящему времени не привели к единому мнению. Тем не менее, СМД в ряде случаев нашли успешное применение в медицине (22-24) и ветеринарии (25, 26).

Нами впервые изучено влияние производных бензимидазола на устойчивость сперматозоидов быков и жеребцов к повреждающему действию низких и ультранизких температур при криоконсервации и показано, что наибольшую активность и сохранность отмечали при введении в среду для замораживания спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10 ^{- 1} 3 -10 ^{- 15} М.

Цель работы — исследование влияния низких и сверхнизких концентраций производных бензимидазола на живучесть сперматозоидов при разбавлении, замораживании и оттаивании, их устойчивость при холодовом шоке и в средах с разной осмолярностью.

Методика . Производные бензимидазола были синтезированы на кафедре органической химии Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. Используемые концентрации анализируемых веществ в разбавителе — 10 - 3 , 10 ^{- 5}, 10 ^{- 11}, 10 ^{- 13}, 10 ^{- 15} М.

В опытах использовали сперму быков ( n = 11) черно-пестрой породы Ленинградского типа (ФГУП «Невское», Ленинградская обл.) и лошадей ( n = 10) тракененской, ганноверской, арабской и голштинской пород (ООО «Ковбой», фермерское хозяйство Маланичевых и частные владельцы, Ленинградская обл.). Сперма быков имела начальную подвижность 5-6 баллов (по этому показателю образцы не были допущены к замораживанию для производственных целей; при измерении скорости дыхания использовали образцы с большей подвижностью), жеребцов — 7-8 баллов. Для сравнения вариантов опыта каждый эякулят делили на равные части.

При определении устойчивости сперматозоидов быков к изменению осмотического давления и холодовому шоку в качестве разбавителя применяли водный раствор лактозы. Контролем был раствор с осмолярностью 336 мосм/л, содержащий 11,5 г лактозы на 100 мл воды; для повышения или снижения осмолярности в ряду 246, 276, 306, 336 и 366 мосм/л это количество лактозы увеличивали или уменьшали (на каждые 30 мосм/л — по 1,02 г). Процедура замораживания образцов соответствовала межгосударственному стандарту ГОСТ 26030-2015 (27). Холодовой шок сперматозоидов быков вызывали снижением температуры разбавленной спермы от 20 до 4 ° С в течение 2 мин.

Сперму жеребцов разбавляли в среде Kenney (49 г D-глюкозы, 24 г сухого молока, 40 мг гентамицина, 1 л дистиллированной воды) в объемном соотношении 1:3, затем центрифугировали 8 мин при 600 g. Осадок сперматозоидов суспендировали в среде Kenney и разбавляли до плотности 100 млн кл/мл, сперму расфасовывали в соломинки по 0,5 мл, охлаждали 299

при 4 ° С 90 мин и замораживали в парах жидкого азота 12 мин при температуре 110 ° С, после чего опускали в жидкий азот. Оттаивали сперму жеребцов при 37 ° С 1-2 мин.

Объем, количество и подвижность сперматозоидов (полное отсутствие — 0 баллов, 100 % — 10 баллов) оценивали общепринятыми методами, морфологию и состояние акросомного чехлика — при фазово-контрастной световой микроскопии. Время переживания спермы быков выражали в часах до сохранности 10 % подвижных клеток и до полной потери подвижности.

Дыхательную активность клеток определяли согласно описанию (28) на полярографе LP 7 (Чехия) с платиновым электродом Кларка. Инкубационной средой служила 6 % глюкоза, в которую последовательно добавляли (в расчете на конечную концентрацию) сперму (50-100 млн спрематозоидов на 1 мл), сукцинат калия в качестве субстрата (1,0*10 ^{- 3}-2,5*10 — 3 М), классический разобщитель дыхания и фосфорилирования про-тонофор 2,4-динитрофенол (ДНФ, 2,5*10 ^{- 5} М).

Поврежденность плазматических мембран сперматозоидов жеребцов оценивали с помощью красителя Sperm VitalStain («Nidacon International AB», Швеция). Окрашивание проводили в пробирках типа Eppendorf (50 мкл спермы смешивали с 50 мкл красителя) и делали мазки на предметных стеклах. Препараты просматривали при увлечении ½100 (объектив) с масляной иммерсией, подсчитывая не менее 200 клеток в каждом образце (белые клетки — неповрежденные, красные или розовые — сперматозоиды с поврежденными мембранами).

Для микроскопирования использовали визуализирующую систему Axio Imager («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия»).

Данные обрабатывали в программах SigmaPlot 12.5 («Systat Software Inc.», США) и Micrisoft Excel. Выполняли общий статистический анализ и оценку средней разницы между выборками с попарно связанными вариантами. Различия считали статистически значимыми при P < 0,05. В таблицах приведены значения средних ( Х ) и стандартной ошибки среднего ( õ ).

Результаты . Один из возможных подходов к практическому решению проблемы сохранности криоконсервированных сперматозоидов — изыскание способов повышения их устойчивости к повреждающему эффекту низких температур. К настоящему времени накоплено достаточно данных о влиянии охлаждения на клетки (29, 30), которые позволяют сделать определенные выводы о механизмах повреждения и подходах к предотвращению этих повреждений. Можно выделить два типа повреждений клеточных структур, возникающих при действии холода: связанные с охлаждением до начала замерзания и возникающие в результате кристаллообразования при замораживании. Среди факторов, влияющих на выживаемость клеток и тканей при криоконсервации, выделяют холодовой шок (31) и изменения осмотического давления при разбавлении, замораживании и оттаивании спермы.

При сравнении времени переживания сперматозоидов быков при температуре 20 ° С в присутствии в среде для разбавления трех производных бензимидазола в концентрациях 10 — 3 -10 ^{- 15} М было установлено, что живучесть сперматозоидов быков при хранении в лактозо-цитратной среде повышалась. Наибольший положительный эффект дали этил-1-бензимида-зол-2-ил-сульфанил в концентрации 10 ^{- 5} М (превышение на 46 %), 2-этил-сульфанилбензимидазол-1-ил в концентрации 10 ^{- 11} М (на 59 %) и 2-бен-зимидазол-1-ил-1-уксусная кислота в концентрациях 10 ^{- 11} М, 10 ^{- 13} М и 300

10 - 15 М (на 88-90 %).

Сравнение действия наиболее эффективных концентраций изученных производных при повышенной плюсовой температуре (40 ° С) (табл. 1) показало, что наибольшую активность и живучесть сперматозоидов быков после замораживания-оттаивания обеспечивало присутствие в среде для разбавления спермы 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизких концентрациях 10 ^{- 13}-10 ^{- 15} М, при которых на один сперматозоид приходилось всего 4-6 молекул исследуемого вещества. В этом варианте доля выживших сперматозоидов (активность) была на 8-13 % достоверно больше (Р < 0,01), чем в контроле. Время переживания до сохранения подвижности 10 % сперматозоидов увеличивалось на 73 %, до полного прекращения подвижности — превышало контроль на 85-90 %.

1. Переживаемость бычьих сперматозоидов при 40 ° С после замораживания и оттаивания в среде с производными бензимидазола в сверхмалых концентрациях ( n = 7, Х ± õ )

Вариант	Активность после размораживания, балл	Время переживания, ч
		до 1 балла (10 %) до 0 баллов
Контроль Производное бензимидазола, M:	2,6±0,28	1,5±0,18	2,0±0,19
этил-1-бензимидазол-2-ил-сульфанил, 10 - 5	3,2±0,01	2,3±0,22*	2,9±0,21**
2-этилсульфанилбензимидазол- 1-ил, 10 - 11	3,0±0,23	2,0±0,23	3,2±0,18**
2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота, 10 - 11	3,2±0,38**	2,0±0,21	2,9±0,24**
2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота, 10 - 13	3,9±0,26***	2,6±0,21***	3,7±0,21***
2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота, 10 - 15	3,4±0,07***	2,6±0,09***	3,8±0,15***

П р и м е ч а н и е. Использована сперма быков с исходной активностью 5-6 баллов.

*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при P < 0,01.

Аналогичные результаты получили при замораживании и оттаивании спермы жеребцов в среде с 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислотой в концентрации 10 ^{- 13} М: число подвижных неповрежденных клеток оказалось больше на 15,2±3,49 млн/мл (Р < 0,01), чем в среде без добавки, выживаемость сперматозоидов после замораживания-оттаивания повысилась на 8,1 % (Р < 0,01), сохранность акросом — на 1,9±0,63 % (Р < 0,05).

2. Сохранность бычьих сперматозоидов под влиянием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты (10 ^{- 13} М) при температуре 40 ° С в среде с разной осмолярностью ( n = 11, Х ± õ )

Осмолярность среды, мосм/л	Подвижных клеток, %
	после разбавления		через 1 ч при 40 ° С		через 2 ч при 40 ° С
	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль	опыт
366	28±4,8а	42±5,8а	10±0,9g	14±1,6g	0	0
336	60±3,2A	60±3,2B	29±3,7d	41±3,3d	11i±2,4	26i±3,0
306	24±2,4b	40±4,4b	11±1,6e	19±2,7e	0	6±1,6
276	15±2,2c	31±4,0c	0	12±1,5	0	0
246	4±2,4*	20±3,2*	0	6±1,8	0	0
П р и м е ч а н и е.	Использована сперма быков с исходной активностью 5-6 баллов.

* Различия в вариантах aa, bb, cc, dd, ee, ii, Aa, Ab, Bb и Ba статистически значимы при Р < 0,01, в gg — при P < 0,05.

2-Бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота в той же концентрации 10—13 М положительно влияла и на устойчивость бычьих сперматозоидов при изменении осмолярности среды для разбавления (табл. 2). Сразу после разбавления при комнатной температуре (20 °С) в изотонической для бычьих сперматозоидов осмолярности (336 мосм/л) 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусная кислота не влияла на активность клеток по сравнению с контрольной. Однако через 1 и 2 ч после хранения (при 40 °С) в присутствии добавки подвижность сперматозоидов в изотонической среде оказалась выше соответственно на 12 и 15 % (P < 0,01), чем в контроле. При уменьшении или увеличении осмолярности среды относительно изотонической на 30 мосм/л доля подвижных клеток в сперме снижалась сразу при разбавлении (см. табл. 2), однако в среде с 2-бензимидазол-1-ил-1-уксус-ной кислотой (10-13 М) — только на 18-20 %, тогда как в контроле — на 32-36 %. В гипоосмотических условиях через 1 ч в контроле наблюдали полную гибель сперматозоидов, а в опыте 6-12 % клеток сохраняли подвижность. В гиперосмотических условиях (366 мосм/л) через 1 ч доля подвижных сперматозоидов в опыте была достоверно выше по сравнению с контролем — на 14 % (P < 0,05).

Фазово-контрастная микроскопия не выявила морфологических различий в структуре акросомы и жгутика сперматозоидов между опытным и контрольным вариантами сразу после разбавления спермы, тогда как разная осмолярность среды приводила к изменению сохранности и живучести сперматозоидов (см. табл. 2). После холодового шока в контрольной среде 40 % сперматозоидов утратили двигательную активность, в то время как в варианте с 10 ^{- 13} М 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислотой подвижность сперматозоидов уменьшилась на 26 %. Можно предположить, что наблюдаемое повышение устойчивости клеток к осмотическим воздействиям и холодовому шоку связано с защитным эффектом, который оказывают исследованные производные бензимидазола на мембранные структуры сперматозоидов.

Как известно, подвижность и время переживания сперматозоидов зависят от работы системы энергообеспечения — дыхания и фосфорилирования и напрямую связаны с функциональным состоянием митохондрий. Мембраны митохондрий наиболее чувствительны к действию повреждающих факторов (28). Сукцинат усиливает клеточное дыхание, проникая только через поврежденную плазматическую мембрану, а динитрофенол служит разобщителем тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования (28). В наших опытах (табл. 3) стимуляция дыхания бычьих сперматозоидов сукцинатом после замораживания и оттаивания в присутствии 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты (10 ^{- 13} М) была ниже, а ДНФ — выше, чем в контроле, что указывает на лучшую сохранность функции энергетического аппарата при использовании добавки. Этим подтверждается предположение, что сверхмалые концентрации (дозы) исследованных производных бензимидазола способствуют повышению устойчивости мембранных структур сперматозоидов к действию сверхнизкой температуры.

3. Изменение скорости дыхания у бычьих сперматозоидов под влиянием 2-бен-зимидаз о л-1-ил-1-уксусной кислоты (10 ^{- 13} М) при замораживании и оттаивании ( Х ± õ )

Сперма	Активность, балл	Дыхание, нмоль О 2/ мин
		скорость	стимуляция
			сукцинанатом К 1	ДНФ
Свежеразбавленная После замораживания и оттаивания:	7,0-8,0	130,0±1,56	1,06±0,012	2,20±0,050
контроль	4,0-5,0	77,0±3,82	2,03±0,187	1,57±0,029
опыт	4,5-6,0	88,0±5,03	1,47±0,730*	1,84±0,021*

Прим еч ани е. ДНФ — 2,4-динитрофенол.

* Различия с контролем статистически значимы при P < 0,01.

Известно, что при охлаждении и замораживании сперматозоидов происходит выход ионов K+ в среду, что отрицательно сказывается на живучести клеток (31). Производные бензимидазола служат ингибиторами Н+/К+-АТФазы плазматической мембраны и предотвращают избыточный выход K+. По-видимому, взаимодействуя с рецептором на внешней мембране сперматозоида, производные бензимидазола вызывают каскадную пе-302

рестройку мембранных структур клетки. Одновременно изменяется вязкость воды вследствие возникновения водородных связей между молекулами с образованием кластеров. В результате может повышаться устойчивость мембранных структур к повреждающему действию колебаний осмотического давления, происходящих при замораживании и оттаивании. Кроме того, возможно, при замерзании воды изменяется характер кристаллообразования в сторону уменьшения размера кристаллов, что снижает их повреждающее влияние. Отсутствие выраженного действия изученных веществ в промежуточных концентрациях согласуется с классической теорией свободных рецепторов R.P. Stephenson (32-34), согласно которой максимальный эффект достигается при связывании лиганда только с небольшой частью рецепторов.

Итак, при введении 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты в сверхнизкой концентрации 10 ^{- 1} 3 -10 ^{- 15} М в среду для замораживания спермы быков и жеребцов отмечали наибольшую активность и сохранность сперматозоидов (по времени переживания и доле сохраняющих подвижность клеток) после замораживания и оттаивания, холодового шока при изменении осмолярности и повышенной температуре (40 ° С). Динитрофенол практически одинаково усиливал клеточное дыхание в опыте и в контроле, тогда как сукцинат, который проникает через поврежденные мембраны, оказывал меньшее стимулирующее влияние в присутствии 2-бензи-мидазол-1-ил-1-уксусной кислоты. Наблюдаемый эффект предположительно связан с защитным действием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты на плазматическую мембрану и мембранные структуры митохондрий сперматозоидов вследствие взаимодействия молекулы исследуемого вещества с рецептором на внешней мембране, а также с возможным влиянием 2-бензимидазол-1-ил-1-уксусной кислоты на состояние молекул воды, ассоциированных с мембранными белками.