Молекулярные маркеры. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Генетическая паспортизация - мощное дополнение к традиционным методам сортоиспытания и эффективный способ идентификации сортов сельскохозяйственных растений. В Российской Федерации, как и во всем мире, переходят к внедрению современных ДНК-технологий в селекционные программы, в систему регистрации сортов и коммерческого распространения семян, однако в работе с кормовыми травами преобладают подходы, основанные на фенотипической оценке. Это снижает эффективность отбора, увеличивает сроки и затраты на выведение новых сортов, их регистрацию и правовую защиту. В представленной работе впервые проведена оценка генетического полиморфизма коллекции российских и зарубежных сортов клевера лугового с помощью SSR- и SRAP-маркеров, выявлены сортоспецифичные ДНК-фрагменты для дифференциации изучаемого материала, уникальность которых подтверждена секвенированием. На основе полученных результатов для ряда российских сортов составлены эталонные генетические паспорта. Наша цель заключалась в разработке системы определения сортовой принадлежности и эталонных генетических паспортов на основе SSR- и SRAP-маркеров для российских сортов клевера лугового. Материалом служили семена 15 российских сортов клевера лугового ( Trifolium pratense L.), полученные в ЦКП Биологические коллекции кормовых растений (ФНЦ ВИК им. В.Р. Вильямса) и 6 образцов зарубежной селекции из Коллекции генетических ресурсов Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова. Геномную ДНК выделяли из суммарной навески части растительной ткани 30 7-суточных проростков от каждого сорта. Использовали базовый SDS-метод с модификациями. Количественные и качественные показатели полученных ДНК-проб определяли посредством электрофореза в агарозном геле, измерения концентрации и оценки чистоты. Финальную концентрацию образов перед использованием в ПЦР доводили до 30 нг/мкл. Генотипирование выполняли с помощью 35 микросателлитных маркеров (база данных Red Clover Marker Database, http://marker.kazusa.or.jp/Red_clover) и 40 комбинаций праймеров к SRAP-мар-керам. При анализе 12 сортов клевера лугового с использованием 35 SSR-маркеров было получено 476 продуктов амплификации. Определены 8 пар микросателлитных (SSR) локуcов, идентифицирующих сорта в изучаемой выборке. Из 40 испытанных комбинаций праймеров, разработанных к SRAP-маркерам, выбрали 18 для анализа на расширенной коллекции из 16 российских и зарубежных сортов. С их использованием было выявлено 812 продуктов ПЦР, включая 85 полиморфных, что составило 10,5 %. Набор из 7 SRAP-маркеров можно использовать для определения сортовой принадлежности. Для верификации результатов уникальные для соответствующих сортов фрагменты ДНК были секвенированы. Аннотированные нуклеотидные последовательности, идентифицирующие сорта Трифон, Марс, Топаз, Атлант, Тетраплоидный ВИК, Метеор, ВИК 77, депонированы в международной базе генетических ресурсов GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основе данных ДНК-фингерпринтинга составлены молекулярно-генетические формулы, отображающие аллельный состав микросателлитных локусов и полиморфизм интрон-экзонных участков генома, и разработаны 10 эталонных генетических паспортов для сортов клевера лугового российской селекции.
Бесплатно
Статья научная
При промышленном семеноводстве сахарной свеклы ( Beta vulgaris L . ssp. vulgaris ) необходимо строго следить за поддержанием качества и размножением линий - компонентов гибридов. Одним из инструментов сопровождения этого процесса может быть метод микросателлитного анализа. Имеется множество сообщений о микросателлитных локусах в геноме сахарной свеклы. Однако для их использования в селекционной практике нужна высокопроизводительная и удобная в применении технология анализа. Для создания такой технологии, позволяющей получать стабильные ДНК-профили, требуется более детальное изучение геномных микросателлитных профилей на большой выборке верифицированного селекционного материала сахарной свеклы. В представленном исследовании впервые проведен детальный анализ первичной структуры ряда микросателлитных локусов генома сахарной свеклы с целью определения природы полиморфизма этих участков генома и их пригодности для получения устойчивых ДНК-профилей. Совместно с селекционерами (ФГБНУ Первомайская селекционно-опытная станция сахарной свеклы, г. Гулькевичи, Краснодарский край) нами была отобрана коллекция из 146 образцов сахарной свеклы ( B. vulgaris ), включающая 28 МС-линий, 28 линий О-типа, 82 линии-опылителя, 6 гибридов отечественной селекции (Азимут, Корвет, Первомайский, Рубин, Фрегат, Успех), гибриды Добрава и Доротея. Этот растительный материал был проанализирован по 12 микросателлитным локусам - FDSB 502, FBSB 1001, FDSB 1033, Unigene 27833, Unigene 26753, Unigene 16898, Unigene 17623B, Unigene 15915, Unigene 17923, SB 04, SB 09, SB 15. Аллельные варианты каждого локуса были амплифицированы, клонированы в плазмидный вектор pAL2-T и секвенированы. Результаты секвенирования аллелельных вариантов микросателлитных локусов FDSB 1001, FDSB 1033, Unigene 16898, Unigene 17623B, Unigene 26753, Unigene 17923, Unigene 27833, SB 04 подтвердили, что полиморфизм длин этих локусов обусловлен исключительно числом тандемных повторов в амплифицируемом фрагменте ДНК. Локус Unigene 15915 был исключен из дальнейшей работы, поскольку в нуклеотидных последовательностях его аллельных вариантов, помимо микросателлитных повторов (CА)n, были выявлены дополнительные инсерции и делеции. Полиморфизм аллельных вариантов микросателлитных локусов SB 09, SB 15 и FDSB 502 обусловлен сложными (составными) повторами. При этом локусы SB 09 и SB 15 были выбраны для дальнейшей работы, поскольку обеспечивали получение стабильных ДНК-профилей. По аллельным вариантам локуса FDSB 502 был выявлен полиморфизм (TC)n(GAT)n(AAG)n, что в ряде случаев может осложнять получение достоверных результатов генотипирования. Поэтому для использования локуса FDSB 502 при создании технологии генетического анализа линий и гибридов сахарной свеклы мы предлагаем использовать разработанные нами праймеры, фланкирующие только его вариабельные микросателлитные повторы (GAT)n и (AAG)n. Полученные в представленном исследовании результаты предполагается в дальнейшем использовать для создания технологии генетического анализа линий и гибридов сахарной свеклы. Такая технология может стать надежным лабораторным инструментом для сопровождения селекционного процесса и промышленного семеноводства сахарной свеклы.
Бесплатно
