Вспомогательные репродуктивные технологии. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Технология получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVEP) с использованием ооцитов, выделенных посредством трансвагинальной пункции фолликулов (ovum-pickup, OPU) позволяет получать большее число потомков от лучших матерей и все чаще используется в скотоводстве в программах по тиражированию и сохранению ценных генотипов. Для повышения эффективности OPU/IVEP-технологии в представленной работе мы впервые культивировали OPU-ооциты коров в присутствии внеклеточных везикул (extracellular vesicles, EVs) из фолликулярной жидкости (ФЖ) яичников коров и определили способность таких ооцитов к эмбриональному развитию in vitro после экстракорпорального оплодотворения. Цель работы заключалась в изучении влияния EVs на OPU-ооциты коров с точки зрения их созревания и последующей способности развиваться до стадии бластоцисты, а также устойчивости полученных бластоцист к замораживанию. EVs из ФЖ выделяли методом дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования при 100000 g. Образцы проанализировали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила, что в выделенных препаратах присутствуют EVs, соответствующие по размерам экзосомам. Донорами ооцитов были половозрелые телки ярославской породы ( n = 6) с естественным половым циклом. OPU проводили 2 раза в неделю. Для созревания выделенные ооциты культивировали в среде ТС-199, дополненной фетальной бычьей сывороткой (10 %), фолликулостимулирующим и лютеинизирующим (10 мкг/мл) гормонами, эпидермальным фактором роста (10 нг/мл) в отсутствие (контроль) или в присутствии EVs (опыт). Везикулярный белок добавляли в среду in vitro созревания (in vitro maturation, IVM) в физиологической концентрации (на 1 мл среды - количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ). Через 24 ч созревания ооциты подвергали экстракорпоральному оплодотворению и культивированию для эмбрионального развития. На 3-и сут после оплодотворения изучали морфологию раздробившихся оплодотворенных ооцитов, на 7-е сут культивирования определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (Бл). Полученные Бл замораживали, некоторое время хранили при -196 °С, после чего размораживали и культивировали до стадии вылупления, определяя жизнеспособность эмбрионов. Всего провели 10 независимых экспериментов. Число ооцитов в контроле и опыте было одинаковым и составило соответственно 57 и 56 клеток. Мы не выявили влияния условий культивирования на завершение ядерного созревания. Доля созревших ооцитов была сходной в обеих группах и составила в контроле и опыте соответственно 90,4±5,6 и 94,3±3,1 %. Также присутствие EVs в среде IVM не изменяло долю раздробившихся ооцитов после оплодотворения in vitro, которая составила 78,6±7,3 и 86,7±4,9 % соответственно для контроля и опыта. Тем не менее обнаружено положительное влияние EVs на развитие созревших ооцитов до стадии Бл. При культивировании OPU-ооцитов в контрольной среде выход Бл составлял 26,6±5,81 %. Введение EVs в среду IVM повышало этот показатель до 41,2±3,2 % (p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }
Бесплатно
Результаты получения и трасплантации IVEP эмбрионов у овец (Ovis aries)
Статья научная
Необходимость развития технологии получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVEP) у овец обусловлена ее использованием в исследованиях по разведению и сохранению ценных животных, а также созданию новых генотипов методом геномного редактирования. В представленной работе впервые для отечественной практики сообщается о получении in vitro у овец полноценных эмбрионов и рождении живого потомства после их трансплантации животным-реципиентам. Цель исследования заключалась в разработке основных этапов технологии IVEP у вида Ovis aries и оценке ее эффективности в условиях in vitro и in vivo. Источником половых клеток самок служили яичники половозрелых ярок и овцематок разной породной принадлежности и возраста, полученные после убоя (post mortem). Видимые фолликулы рассекали и выделяли ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) ( n = 1028). Отобранные по качеству ОКК ( n = 620) культивировали группами по 25-35 шт. в течение 24 ч в 500 мкл среды ТС-199, дополненной 10 % фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл фолликулостимулирующего и 10 мкг/мл лютеинизирующего гормонов, 10 нг/мл эпидермального фактора роста. Часть созревших яйцеклеток ( n = 96) использовали для цитологического анализа степени ядерного созревания, оставшуюся часть ( n = 524) переносили в среду BO-IVF («IVF Bioscience», Великобритания) для экстракорпорального оплодотворения. Гранулы замороженной спермы барана породы катадин размораживали и обрабатывали методом swim-up с использованием среды Sperm-TALP (G.N. Singina, 2019). Созревшие ооциты овец культивировали совместно со сперматозоидами в среде BO-IVF в течение 15-16 ч, после чего их переносили в среду эмбрионального развития BO-IVС («IVF Bioscience», Великобритания). Через 2 сут инкубации оценивали раздробившиеся эмбрионы, часть из них трансплантировали животным-реципиентам, на 7-е сут определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты. Двухсуточные эмбрионы пересаживали синхронным по половому циклу яркам романовской породы ( n = 6) эндохирургически (В.А. Луканина с соавт., 2023) методом двухпортовой лапароскопии под местной анестезией. Через 35-42 сут с момента трансплантации эмбрионов овец-реципиентов исследовали на суягность и затем вели наблюдение за развитием у них плодов вплоть до рождения живого потомства. По результатам цитологического анализа доля ядерного созревания ооцитов составила 77,1 % (74 из 96). Из 524 созревших и оплодотворенных ооцитов 316 клеток (60,3 %) преодолели первое деление дробления. Животным-реципиентам пересадили 92 раздробившихся эмбриона. Из 224 оставшихся и продолживших развитие in vitro ранних эмбрионов 34,8 % достигли стадии бластоцисты. По данным ультразвуковой диагностики, доля суягных животных после трансплантации эмбрионов шести реципиентам составила 50 % (3 из 6), 33,3 % пересадок (2 из 6) завершились рождением живого потомства. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об эффективности применяемой IVEP технологии: получаемые с ее использованием эмбрионы полноценны и способны развиваться до жизнеспособного потомства. Есть все основания полагать, что предложенная технология получения эмбрионов in vitro и их трансплантации животным-реципиентам может быть применена на практике в работах по воспроизводству и геномному редактированию у овец.
Бесплатно
