Присутствие внеклеточных везикул фолликулярного происхождения в среде созревания донорских ооцитов коров повышает их способность к эмбриональному развитию in vitro

Технология получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVEP) с использованием ооцитов, выделенных посредством трансвагинальной пункции фолликулов (ovum-pickup, OPU) позволяет получать большее число потомков от лучших матерей и все чаще используется в скотоводстве в программах по тиражированию и сохранению ценных генотипов. Для повышения эффективности OPU/IVEP-технологии в представленной работе мы впервые культивировали OPU-ооциты коров в присутствии внеклеточных везикул (extracellular vesicles, EVs) из фолликулярной жидкости (ФЖ) яичников коров и определили способность таких ооцитов к эмбриональному развитию in vitro после экстракорпорального оплодотворения. Цель работы заключалась в изучении влияния EVs на OPU-ооциты коров с точки зрения их созревания и последующей способности развиваться до стадии бластоцисты, а также устойчивости полученных бластоцист к замораживанию. EVs из ФЖ выделяли методом дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования при 100000 g. Образцы проанализировали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила, что в выделенных препаратах присутствуют EVs, соответствующие по размерам экзосомам. Донорами ооцитов были половозрелые телки ярославской породы ( n = 6) с естественным половым циклом. OPU проводили 2 раза в неделю. Для созревания выделенные ооциты культивировали в среде ТС-199, дополненной фетальной бычьей сывороткой (10 %), фолликулостимулирующим и лютеинизирующим (10 мкг/мл) гормонами, эпидермальным фактором роста (10 нг/мл) в отсутствие (контроль) или в присутствии EVs (опыт). Везикулярный белок добавляли в среду in vitro созревания (in vitro maturation, IVM) в физиологической концентрации (на 1 мл среды - количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ). Через 24 ч созревания ооциты подвергали экстракорпоральному оплодотворению и культивированию для эмбрионального развития. На 3-и сут после оплодотворения изучали морфологию раздробившихся оплодотворенных ооцитов, на 7-е сут культивирования определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (Бл). Полученные Бл замораживали, некоторое время хранили при -196 °С, после чего размораживали и культивировали до стадии вылупления, определяя жизнеспособность эмбрионов. Всего провели 10 независимых экспериментов. Число ооцитов в контроле и опыте было одинаковым и составило соответственно 57 и 56 клеток. Мы не выявили влияния условий культивирования на завершение ядерного созревания. Доля созревших ооцитов была сходной в обеих группах и составила в контроле и опыте соответственно 90,4±5,6 и 94,3±3,1 %. Также присутствие EVs в среде IVM не изменяло долю раздробившихся ооцитов после оплодотворения in vitro, которая составила 78,6±7,3 и 86,7±4,9 % соответственно для контроля и опыта. Тем не менее обнаружено положительное влияние EVs на развитие созревших ооцитов до стадии Бл. При культивировании OPU-ооцитов в контрольной среде выход Бл составлял 26,6±5,81 %. Введение EVs в среду IVM повышало этот показатель до 41,2±3,2 % (p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }