Технологии waste-to-profit. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Биодеградация кератина пера сельскохозяйственной птицы микроорганизмами, обладающими кератинолитической активностью, представляет альтернативный привлекательный метод повышения питательной ценности отходов и предотвращения загрязнения окружающей среды. Кератинолитические протеазы используются для получения редких аминокислот - пролина, серина и цистеина. Бактериальный гидролизат перьев можно применять в качестве ингредиента корма для животных или органического удобрения, благодаря чему снижается воздействие отходов птицеводства на окружающую среду. В настоящей работе впервые установлено, что при переработке пера цыплят-бройлеров штаммом Bacillus licheniformis БАЛ-2, который использует перо в качестве единственного источника углерода, свободный кератин полностью превращается в перевариваемые пептиды и незаменимые аминокислоты. Цель работы заключалась в изучении морфологических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических свойств штаммов Bacillus licheniformis БАЛ-1 и БАЛ-2, их идентификации и использования для ферментации пера цыплят-бройлеров. Штаммы Bacillus licheniformis БАЛ-1 (ВКПМ В-14243) и БАЛ-2 (ВКПМ В-14244) - природные изоляты, выделенные из донных отложений Финского залива Балтийского моря (д. Кандикюля). Куриное перо цыплят-бройлеров кросса Ross 308 (Птицеперерабатывающий комплекс «Константиново», ПАО «Группа Черкизово», с. Константиново, Московская обл., Раменский р-н) поступило с промышленной линии ощипывания птицы, имело включения крови, влажность 75 % и подвергалось ферментации через 24 ч после получения. Морфотипы колоний B. licheniformis определяли на триптон-соевом агаре. Геномную ДНК бактерий выделяли с использованием набора реагентов («Thermo Scientific», Литва). Фрагмент 16S рДНК амплифицировали в ПЦР со специфичными праймерами для гена 16S рРНК эубактерий: 8f 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и 1492r 5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'. Идентичность нуклеотидных последовательностей анализировали с помощью программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Для ферментации пера в колбу, содержащую 100 см3 минерально-питательной среды, помещали 5 г измельченного пера птицы. Штамм B. licheniformis БАЛ-1 или БАЛ-2 вносили в минеральную среду до конечной концентрации 1½106 КОЕ/см3. Ферментацию пера проводили в течение 72 ч при 28 °С и постоянном перемешивании. В культуральной жидкости определяли кератиназную активность с использованием суспензии кератина. Раствор фермента (1 см3) добавляли к суспензии кератина (1 см3) в реакционном буфере. После 1 ч инкубации при 37 °C реакцию останавливали добавлением 2 см3 5 % ТХУ и раствор фильтровали. Ферментированное перо исследовали методом растровой электронной микроскопии. Двумерный гель-электрофорез выполняли по О'Фарреллу c изоэлектрофокусированием в амфолиновом градиенте pH (IEF-PAGE); белки детектировали последовательным окрашиванием кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром. При подготовке препаратов для 2D электрофореза 100 мг измельченного образца гомогенизировали в 2 см3 лизирующего раствора. Гомогенат осветляли центрифугированием, фракцию супернатанта, содержащую экстракт белков, использовали для разделения в равных нанесениях по 50-75 мкл. После трипсинолиза белковые фракции идентифицировали с помощью MALDI-TOF MS/MS масс-спектрометрии (масс-спектрометр Ultraflex, «Bruker Daltonics GmbH & Co. KG», Германия) с УФ-лазером (λ = 336 нм) в режиме детекции положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да. Тонкослойную бумажную хроматографию проводили по ГОСТ 28366-89. Содержание общего азота в высушенном пере после ферментации оценивали методом Кьельдаля. Геномный фингерпринт осуществляли методом rep-ПЦР с праймерами Rep1R-I и Rep2-I ERIC-PCR (набор праймеров ERIC1R и ERIC2), ERIC2-PCR c праймером ERIC2, BOX-PCR c праймером BOX A1R и (GTG)5-PCR с праймером (GTG)5. Для подготовки ДНК-матриц по одной колонии культур микроорганизмов отбирали, суспендировали в 20 мкл деионизированной воды и обрабатывали в микроволновой печи в течение 2 мин на максимальной мощности. Полученные препараты хранили при -20 °С и размораживали перед использованием в ПЦР. По результатам анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК было установлено, что штаммы БАЛ-1 и БАЛ-2 принадлежат виду Bacillus licheniformis . Штаммы способны расти на минеральной среде с куриным пером как единственным источником углерода до концентрации 1×108 КОЕ/см3. При высеве аликвот из разных разведений выявили 16 морфотипов колоний. Для штамма B. licheniformis БАЛ-1 обнаружено 10 морфотипов, для B. licheniformis БАЛ-2 - 6 морфотипов. Методом геномного фингерпринта на основе ПЦР подтверждена сохранность выявленных морфотипов штаммов. Кератиназная активность штамма B. licheniformis БАЛ-1 составила 16,2±0,3 КА/см3, штамма B. licheniformis БАЛ-2 - 18,3±0,2 КА/см3.
Бесплатно
Развитие большого мучного хрущака (Tenebrio molitor L.) под влиянием антибиотика цефтриаксона
Статья научная
Антибиотики, попадающие в почву с отходами, а из почвы в растения, способны оказывать влияние на насекомых в их естественной среде обитания. Кроме того, антибиотики часто содержатся в кормах, которые используются не только на животноводческих предприятиях, но и на фермах по выращиванию съедобных и кормовых насекомых. В отходах сельскохозяйственного производства может содержаться значительное количество антибиотиков, которые влияют на рост, развитие и микробиоту насекомых, используемых для их переработки. Цефтриаксон - это антибиотик цефалоспоринового ряда третьего поколения. Влияние антибиотиков цефалоспоринового ряда на насекомых мало изучено, при этом степень влияния зависит как от вида насекомого, так и от типа антибиотика. Большой мучной хрущак - съедобное насекомое, а также вредитель зерновой продукции, который чаще всего обитает в закромах мучных складов, пекарнях, на мельницах, комбикормовых заводах, также рассматривается его использование в биоконверсии отходов. В настоящей работе впервые показано воздействие различных концентраций антибиотика цефтриаксона в кормовом субстрате на массу и выживаемость личинок мучного хрущака, некоторые параметры состава личинок, метаморфоз и численность потомства. Впервые установлена способность T. molitor употреблять кормовой субстрат или перерабатывать отходы, содержащие цефтриаксон. Целью работы была оценка влияния антибиотика цефтриаксона на рост, развитие и размножение большого мучного хрущака. Опыты проводили в инсектарии Всероссийского НИИ пищевых добавок (г. Санкт-Петербург, Россия) с июля по октябрь 2022 года. До эксперимента насекомых выращивали при температуре 25±2 °C и относительной влажности воздуха 50±10 %. Для кормления использовали пшеничные отруби (пищевая ценность на 100 г продукта: белки - 16,0 г, жиры - 4,0 г, углеводы - 65,0 г; ГОСТ 7169-2017. М., 2018) с добавлением моркови в качестве источника влаги. Для исследования были выбраны следующие концентрации цефтриаксона («Биосинтез», Россия): 0; 0,1; 1; 10 и 100 мг/кг сухой массы корма. Для получения корма с определенным содержанием антибиотика готовили растворы цефтриаксона в воде с необходимой концентрацией, добавляли к пшеничным отрубям в соотношении 1:1 при перемешивании, затем отруби высушивали в конвекционном сушильном шкафу UF110plus («Memmert GmbH & Co.KG», Германия) при 40 °С в течение 1 сут при периодическом помешивании. Эксперимент включал три этапа: исследование скорости роста личинок, подсчет окуклившихся и превратившихся в имаго насекомых и оценку яйцекладущей активности T. molitor . Рассчитывали коэффициент конверсии корма (feed conversion ratio, FCR), коэффициент конверсии усвоенного корма (efficiency of conversion of digested food, ECD). Расчет FCR и ECD проводили с учетом влажного корма (моркови) и без учета (только по массе отрубей). Содержание воды в теле личинки определяли, высушивая навеску образцов насекомых на предварительно взвешенных алюминиевых чашечках в вакуумном сушильном шкафу Vacuum Oven OV-12 («Jeio Tech», Корея) при 40 °C до постоянной массы. Для определения зольности личинок высушенные образцы помещали в прокаленные до постоянной массы тигли и сжигали в муфельной печи SNOL 8,2/1100 («Umega Group, AB», Литва) при следующем режиме прокаливания: 60 мин при 250 °C + 6 ч при 550 °C. Жирнокислотный состав определяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на газовом хроматографе Varian 450-GC («Varian Chromatography Systems», Нидерланды) с масс-спектрометрическим детектором Varian 240-MS («Varian, Inc.»,США). Метилирование и экстракцию жирных кислот из высушенных образцов (сушку проводили в вакуумном сушильном шкафу Vacuum Oven OV-12 при 40 °C) осуществляли с помощью 15 % раствора серной кислоты в метаноле и хлороформа. Было установлено, что добавление цефтриаксона в кормовой субстрат большого мучного хрущака в концентрации 100 мг/кг корма привело к небольшому ускорению набора массы личинками (р = 0,029). Зависимости между выживаемостью личинок T. molitor и концентрацией антибиотика не наблюдалось (р > 0,05). Не обнаружено статистически значимых различий между жирнокислотным составом, коэффициентами конверсии корма, зольностью и содержанием воды в теле личинок, питавшихся кормами с различным содержанием цефтриаксона (p > 0,05). Отсутствовала зависимость между концентрацией антибиотика (0-100 мг/кг) и продуктивностью большого мучного хрущака, а также не обнаружено изменений в процессах окукливания и превращения в имаго при добавлении антибиотика в кормовой субстрат (р > 0,05). Таким образом, T. molitor можно выращивать на кормах, в состав которых входит цефтриаксон, сохраняя при этом жизнеспособность и основные характеристики насекомых, необходимые для их дальнейшего использования в технологиях биоконверсии. Полученные данные также указывают на то, что присутствие антибиотика в естественных кормовых субстратах этого вредителя не препятствует его размножению.
Бесплатно
