Новые штаммы Bacillus licheniformis, их идентификация и ферментативная активность при переработке пера в кормовую добавку

Автор: Бетехтин К.Э., Сазонова О.И., Соколов С.Л., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Машенцева Н.Г., Неретина А.Н.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Статья в выпуске: 2 т.59, 2024 года.

Бесплатный доступ

Биодеградация кератина пера сельскохозяйственной птицы микроорганизмами, обладающими кератинолитической активностью, представляет альтернативный привлекательный метод повышения питательной ценности отходов и предотвращения загрязнения окружающей среды. Кератинолитические протеазы используются для получения редких аминокислот - пролина, серина и цистеина. Бактериальный гидролизат перьев можно применять в качестве ингредиента корма для животных или органического удобрения, благодаря чему снижается воздействие отходов птицеводства на окружающую среду. В настоящей работе впервые установлено, что при переработке пера цыплят-бройлеров штаммом Bacillus licheniformis БАЛ-2, который использует перо в качестве единственного источника углерода, свободный кератин полностью превращается в перевариваемые пептиды и незаменимые аминокислоты. Цель работы заключалась в изучении морфологических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических свойств штаммов Bacillus licheniformis БАЛ-1 и БАЛ-2, их идентификации и использования для ферментации пера цыплят-бройлеров. Штаммы Bacillus licheniformis БАЛ-1 (ВКПМ В-14243) и БАЛ-2 (ВКПМ В-14244) - природные изоляты, выделенные из донных отложений Финского залива Балтийского моря (д. Кандикюля). Куриное перо цыплят-бройлеров кросса Ross 308 (Птицеперерабатывающий комплекс «Константиново», ПАО «Группа Черкизово», с. Константиново, Московская обл., Раменский р-н) поступило с промышленной линии ощипывания птицы, имело включения крови, влажность 75 % и подвергалось ферментации через 24 ч после получения. Морфотипы колоний B. licheniformis определяли на триптон-соевом агаре. Геномную ДНК бактерий выделяли с использованием набора реагентов («Thermo Scientific», Литва). Фрагмент 16S рДНК амплифицировали в ПЦР со специфичными праймерами для гена 16S рРНК эубактерий: 8f 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и 1492r 5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'. Идентичность нуклеотидных последовательностей анализировали с помощью программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Для ферментации пера в колбу, содержащую 100 см3 минерально-питательной среды, помещали 5 г измельченного пера птицы. Штамм B. licheniformis БАЛ-1 или БАЛ-2 вносили в минеральную среду до конечной концентрации 1½106 КОЕ/см3. Ферментацию пера проводили в течение 72 ч при 28 °С и постоянном перемешивании. В культуральной жидкости определяли кератиназную активность с использованием суспензии кератина. Раствор фермента (1 см3) добавляли к суспензии кератина (1 см3) в реакционном буфере. После 1 ч инкубации при 37 °C реакцию останавливали добавлением 2 см3 5 % ТХУ и раствор фильтровали. Ферментированное перо исследовали методом растровой электронной микроскопии. Двумерный гель-электрофорез выполняли по О'Фарреллу c изоэлектрофокусированием в амфолиновом градиенте pH (IEF-PAGE); белки детектировали последовательным окрашиванием кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром. При подготовке препаратов для 2D электрофореза 100 мг измельченного образца гомогенизировали в 2 см3 лизирующего раствора. Гомогенат осветляли центрифугированием, фракцию супернатанта, содержащую экстракт белков, использовали для разделения в равных нанесениях по 50-75 мкл. После трипсинолиза белковые фракции идентифицировали с помощью MALDI-TOF MS/MS масс-спектрометрии (масс-спектрометр Ultraflex, «Bruker Daltonics GmbH & Co. KG», Германия) с УФ-лазером (λ = 336 нм) в режиме детекции положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да. Тонкослойную бумажную хроматографию проводили по ГОСТ 28366-89. Содержание общего азота в высушенном пере после ферментации оценивали методом Кьельдаля. Геномный фингерпринт осуществляли методом rep-ПЦР с праймерами Rep1R-I и Rep2-I ERIC-PCR (набор праймеров ERIC1R и ERIC2), ERIC2-PCR c праймером ERIC2, BOX-PCR c праймером BOX A1R и (GTG)5-PCR с праймером (GTG)5. Для подготовки ДНК-матриц по одной колонии культур микроорганизмов отбирали, суспендировали в 20 мкл деионизированной воды и обрабатывали в микроволновой печи в течение 2 мин на максимальной мощности. Полученные препараты хранили при -20 °С и размораживали перед использованием в ПЦР. По результатам анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК было установлено, что штаммы БАЛ-1 и БАЛ-2 принадлежат виду Bacillus licheniformis . Штаммы способны расти на минеральной среде с куриным пером как единственным источником углерода до концентрации 1×108 КОЕ/см3. При высеве аликвот из разных разведений выявили 16 морфотипов колоний. Для штамма B. licheniformis БАЛ-1 обнаружено 10 морфотипов, для B. licheniformis БАЛ-2 - 6 морфотипов. Методом геномного фингерпринта на основе ПЦР подтверждена сохранность выявленных морфотипов штаммов. Кератиназная активность штамма B. licheniformis БАЛ-1 составила 16,2±0,3 КА/см3, штамма B. licheniformis БАЛ-2 - 18,3±0,2 КА/см3.

Еще

Кератинсодержащее сырье, переработка пера, кератиназы, bacillus licheniformis

Короткий адрес: https://sciup.org/142242466

IDR: 142242466 | DOI: 10.15389/agrobiology.2024.2.385rus

Список литературы Новые штаммы Bacillus licheniformis, их идентификация и ферментативная активность при переработке пера в кормовую добавку

Alexander P., Brown C., Arneth A., Finnigan J., Moran D., Rounsevell M.D. A. Losses, inefficiencies and waste in the global food system. Agricultural S ystems , 2017, 153: 190 200 (doi: 10.1016/j.agsy.2017.01.014
KorniKorniłłowicz Kowalska T., Bohacz J. Biodegradation of keratin waste: theory and practical aspects. Waste M anagement , 2011, 31(8): 1689 1701 doi: 10.1016/j.wasman.2011.03.024
Papadopoulos M.C. Processed chicken feathers as feedstuff for poultry and swine. A review. Agricultural Wastes , 1985, 14(4): 275 290 (doi: 10.1016/S0141 4607(85)80009 3).
Tiwary E., Gupta R. Rapid conversion of chicken feather to feather meal using dimeri c keratinase from Bacillus licheniformis ER 15. Journal of Bioprocessing & Biotechniques , 2012, 2(4): 1000123 (doi: 10.4172/2155 9821.1000123).
Gupta R., Ramnani P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Applied M icrobiology and B iotechnology , 2006 70(1) 21 33 (doi: 10.1007/s00253 005 0239 8
Colla G., Hoagland L., Ruzzi M., Cardarelli M., Bonini P., Canaguier R., Rouphael Y. Biostimulant action of protein hydrolysates: unraveling their effects on plant physiology and microbiome. Frontiers in Plant Science , 2017, 8 2202 (doi: 10.3389/fpls.2017.02202
Callegaro K., Brandelli A., Daroit D.J. Bey ond plucking: feathers bioprocessing into valuable protein hydrolysates. Waste Management , 2019, 95: 399 415 (doi: 10.1016/j.wasman.2019.06.040).
Bhari R., Kaur M., Sarup Singh R. Chicken feather waste hydrolysate as a superior biofertilizer in agroindustry. Current Microbiology , 2021, 78(6): 2212 2230 (doi: 10.1007/s00284 021 02491 z).
Nnolim N.E., Okoh A.I., Nwodo U.U. Bacillus sp. FPF 1 produced keratinase with high potential for chicken feather degradation. Molecules , 2020, 25(7): 1505 (doi: 10.3390/molecules25071505).
Akram F., ul Haq I., Jabbar Z. Production and characterization of a novel thermo and detergent stable keratinase from Bacillus sp. NKSP 7 with perceptible applications in leather processing and laundry industries. Interna tional Journal of Biological Macromolecules , 2020, 164: 371 383 (doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.07.146).
Holkar C.R., Jain S.S., Jadhav A.J., Pinjari D.V. Valorization of keratin based waste. Process Safety and Environmental Protection , 2018, 115: 85 98 do i: 10.1016/j.psep.2017.08.045).
Costa J.C., Barbosa S.G., Sousa D.Z. Effects of pre treatment and bioaugmentation strategies on the anaerobic digestion of chicken feathers. Bioresource Technology , 2012, 120: 114 119 (doi: 10.1016/j.biortech.2012.06.047
Swetlana N., Jain P.C. Feather degradation by strains of Bacillus isolated from decomposing feathers. Brazilian J ournal of M icrobiology , 2010, 41 ( 1): 196 200 (doi: 10.1590/S 151783822010000100028).
Bielorai R., Iosif B., Neumark H., Alumot E. Low nutritional value of feather meal protein for chicks. The Journal of N utrition , 1982, 112(2): 249 254 (doi: 10.1093/jn/
Mazotto A.M., de Melo A.C.N., Macrae A., Rosado A.S., Peixoto R., Cedrola S.M.L., Couri S., Zingali R.B., Villa A.L.V., Rabinovitch L., Chaves J.Q., Vermelho A.B. Biodegradation of feather waste by extracellular keratinases and gelatinases from Bacillus spp. World Journal of Microbiology and Biotechnology , 2011, 27(6): 1 355 1365 (doi: 10.1007/s11274 010 0586 1
Ire F.S., Onyenama A.C. Effects of some cultural conditions on keratinase production by Bacillus licheniformis Strain NBRC 14206. Journal of Advances in Biology & Biotechnology , 2017: 1 13. ( 10.9734/JABB/2017/32726
Фисинин В И., Лукашенко В С., Салеева И П., Волик В Г., Исмаилова Д Ю., Овсейчик Е А., Журавчук Е В. Показатели качества мяса цыплят бройлеров Gallus g allus L.) при использовании в рационах ферментативных гидролизатов пера и коллагена. Сельскохозяйственная биология , 2021, 56(2): 384 399 (doi: 10.15389/agrobiology.2021.2.384rus).
Karthikeyan R, Balaji S, Sehgal P. Industrial applications of keratins a review. Journa l of Scientific & Industrial Research , 2007, 66: 710 715.
Gousterova A., Nustorova M., Goshev I., Christov P., Braikova D., Tishinov K., Nedkov P. Alkaline hydrolysate of waste sheep wool aimed as fertilizer. Biotechnology & Biotechnological Equipment , 2003, 17(2) 140 145 (doi: 10.1080/
Cao Z. J., Lu D., Luo L. S., Deng Y. X., Bian Y. G., Zhang X. Q., Zhou M. H. Composition analysis and application of degradation products of whole feathers through a large scale of fermentation. Environmental Science and Pollution Research , 2012, 19(7): 2690 2696 (doi: 10.1007/s11356 012 0763 x).
Bertsch A., Coello N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresource Technology, 2005, 96(15): 1703-1708 (doi: 10.1016/j.biortech.2004.12.026).
Williams C.M., Lee C.G., Garlich J.D., Shih J.C. H. Evaluation of a bacterial feather fermentation product, feather lysate, as a feed protein. Poultry Science , 1991, 70( 85 94 (doi: 10.3382/ps.0700085).
Friedrich A.B., Antranikian G. Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans , a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales. Applied and Environmental Microbiology , 1996, 62( 2875 2882 (doi: 10.1128/aem.62.8.2875 2882.1996).
Williams C.M., Shih J.C.H. Enumeration of some microbial groups in thermophilic poultry waste digesters and enrichment of a feather feather‐degrading culture. Journal of Applied Bacteriology , 1989, 67(1): 25 35 (doi: 10.1111/j.1365 2672.1989.tb04951.x).
Williams C.M., Richter C.S., MacKenzie Jr J.M., Shih J.C. Isolation, identification, and characterization of a feather degrading bacterium. Applied and Environmental Microbiology , 1990, 56(6): 1509 1515 (doi: 10.1128/aem.56.6.1509 1515.1990).
Matsui T., Yamada Y., Mitsuya H., Shigeri Y., Yoshida Y., Saito Y., Matsui H., Watanabe K. Sustainable and practical degradation of intact chicken feathers by cultivating a newly isolated thermophilic Meiothermus ruber H328. Applied M icrobiology and B iotechnology , 2009, 82( 941 950 (doi: 10.1007/s00253 009 1880 4).
Wang T., Liang C., Sun Y., Gao W., Luo X., Gao Q., Li R., Fu S., Xu H., He T., Yuan H. Strategical isolation of efficient chicken feather degrading bacterial strains from tea plantation soil sample. International M i crobiology , 2019, 22(2): 227 237 (doi: 10.1007/s10123 018 00042 4
Li Z. W., Liang S., Ke Y., Deng J. J., Zhang M. S., Lu D. L., Li J. Z., Luo X. C. The feather degradation mechanisms of a new Streptomyces sp. isolate SCUT 3. Communications B iology , 2020, 3(1): 191 doi: 10.1038/s42003 020 0918 0
Bhari R., Kaur M., Singh R.S. Nutritional enhancement of chicken feather waste by Bacillus aerius NSMk2. Indian J ournal of M icrobiology , 2020, 60( 518 525 (doi: 10.1007/s12088 02000897 0).
Ouled Haddar H., Zaghloul T.I., Saeed H.M. Biodegradation of native feather keratin by Bacillus subtilis recombinant strains. Biodegradation , 2009, 20(5): 687 694 (doi: 10.1007/s10532009 9256 0).
He Z., Sun R., Tang Z., Bu T., Wu Q., Li C., Chen H. Biodegradation of feather waste keratin by the keratin degrading strain Bacillus subtilis 8. Journal of M icrobiology and B iotechnology , 2018, 28(2): 314 322 (doi: 10.4014/jmb.1708.08077).
Ramakrishna Reddy M., Sathi Reddy K., Ranjita Chouhan Y., Bee H., Reddy G. Effect ive feather degradation and keratinase production by Bacillus pumilus GRK for its application as bio detergent additive. Bioresource T echnology , 2017 243 254 263 (doi: 10.1016/j.biortech.2017.06.067).
Bihari Z., Vid Vidéki D., Mihalik E., Szvetnik A., Szab Szabó Z., Bal Balázs M., Kesseru P., Kiss I. Degradation of native feathers by a novel keratinase producing, thermophilic isolate, Brevibacillus ther- moruber T1E. Zeitschrift fur Naturforschung. C, Journal of Biosciences , 2010, 65(1 2) 134 140 (doi: 10.1515/znc 201 0 1 221).
Werlang P.O., Brandelli A. Characterization of a novel feather degrading Bacillus sp. strain. Applied B iochemistry and B iotechnology , 2005, 120(1): 71 79 (doi: 10.1385/abab:120:1:71 ).
E l Naghy M.A., E l Ktatny M.S., Fadl Allah E.M., Nazeer W.W. Degradation of chicken feathers by Chrysosporium georgiae. Mycopathologia , 1998, 143(2): 77 84 (doi: 10.1023/a:1006953910743
Zaghloul T.I., Embaby A.M., Elmahdy A.R. Biodegradation of chicken feathers waste directed by Bacillus subtilis recombinant cells: scaling up in a laboratory scale fermentor. Bioresource technology , 2011, 102( 2387 2393 (doi: 10.1016/j.biortech.
Peng Z., Mao X., Zhang J., Du G., Chen J. Effe ctive biodegradation of chicken feather waste by co cultivation of keratinase producing strains. Microbial Cell Factories , 2019, 18(1): 84 (doi: 10.1186/s12934 019 1134 9
Onifade A.A., Al Sane N.A., Al Musallam A.A., Al Zarban S. Potentials for biotechnological applications of keratin degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Bioresourc e Technology , 1998, 66 ( 1): 1 11 (doi: 10.1016/s0960 8524(98)00033 9
Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. Chapter XIII. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat. In: Methods in Microbiology, vol. 2 /J.R. Norris, D. Ribbons (eds.). Academic Press , 2: 277 327 (doi: 10.1016/S0580 9517(08)70227 7)
Ulucay O., Gormez A., Ozic C. Identification, characterization and hydrolase producing performance of thermophilic bacteria: geothermal hot springs in the Eastern and Southeastern Anatolia Regions of Turkey. Antonie van Leeuwenhoek , 2022, 115(2): 253 270 (doi: 10.1007/s10482 021016 78 5
Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of B acteriology 1991 173(2) 697 703 (doi: 10.1128/jb.173.2.697703.1991).
Grzywnowicz G., Lobarzewski J., Wawrzkiewicz K., Wolski T. Comparative characterization of proteolytic enzymes from Trichophyton gallinae and Trichophyton verrucosum. Journal of Medical and Veterinary Mycology , 1989 27(5): 319 328 (doi: 10.1080/
Завьялова Н.Е., Теклева М.В., Полевова С.В., Богданов А.Г. Исследование палинологических объектов методом электронной микроскопии. М.,
Zvereva E.A., Kovalev L.I., Ivanov A.V., Kovaleva M.A., Zherdev A.V., Shishkin S.S. S., Lisitsin A.B., Chernukha I.M., Dzantiev B.B. Enzyme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle compounds in raw meat and some meat products. Meat Science , 2015, 105: 46 52 (doi: 10.1016/j.meatsci.2015.03.001
Versalovic J., Schneider M., de Bruijn F.J., Lupski J.R. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence based polymerase chain reaction. Methods in M olecular and Cellular Biology 1994, 5 ( 25 40.
GRAS Notices. Bacillus licheniformis Режим доступа: https www cfsanappsexternal fda gov scripts fdcc set GRASNotices sort GRN No order DESC startrow = type basic search Bacillus 20 licheniformis Дата обращения:
Haq I.U., Akram F., Jabbar Z. Kerati nolytic enzyme mediated biodegradation of recalcitrant poultry feathers waste by newly isolated Bacillus sp. NKSP 7 under submerged fermentation. Folia M icrobiologica , 2020, 65( 823 834 doi: 10.1007/s12223 020 00793 6).
Jeong J. H., Jeon Y. D., Lee O. M., Kim J. D., Lee N. R., Park G. T., Son H. J. Characterization of a multifunctional feather degrading Bacillus subtilis isolated from forest soil. Biodegradation , 2010, 21(6): 1029 1040 (doi: 10.1007/s10532 010 9363 y
Yusuf I., Ahmad S.A., Phang L.Y., Syed M.A., Shamaan N.A., Khalil K.A. A., Dahalan F.A., kor M.Y. Keratinase production and biodegradation of polluted secondary chicken feather wastes by a newly isolated multi heavy metal tolerant bacterium Alcaligenes sp. AQ05 001. Journal of Environmental Management , 2016, 183 ( 1): 182 195 (doi: 10.1016/j.jenvman.2016.08.059).
Fakhfakh N., Kanoun S., Manni L., Nasri M. Production and biochemical and molecular char- acterization of a keratinolytic serine protease from chicke n feather degrading Bacillus licheniformis RPk. Canadian J ournal of M icrobiology , 2009, 55( 427 436 (doi: 10.1139/w08 143).
Wang J. J., Shih J.C. H. Fermentation production of keratinase from Bacillus licheniformis PWD 1 and a recombinant B. subtilis FDB 29. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology , 1999, 22(6): 608 616 (doi: 10.1038/sj.jim.
Grazziotin A., Pimentel F.A., Sangali S., de Jong E.V., Brandelli A. Production of feather protein hydrolysate by keratinolytic bacterium Vib rio sp. kr2. Bioresource T echnology , 2007, 98(16): 3172 3175 (doi: 10.1016/j.biortech.2006.10.034).
Shapiro J.A. The significances of bacte rial colony patterns. Bioessays , 1995, 17(7): 597 607 (doi: 10.1002/bies.950170706).
Di Franco C., Beccari E., Santini T., Pisaneschi G., Tecce G. Colony shape as a genetic trait in the pattern forming Bacillus mycoides. BMC Microbiology 2002 2 33 (doi: 10.1186/1471 21802 33).
Rudner R., Martsinkevich O., Leung W., Jarvis E.D. Classifi cation and genetic characterization of pattern forming Bacilli. Molecular Microbiology , 1998, 27(4): 687 703 (doi: 10.1046/j.13652958.1998.00717.x).
Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annual R eview of M icrobiology , 1998, 52 ( 81 104 (doi: 10.1146/annurev.micro.
Rademaker J.L.W., Louws F.J., Versalovic J., de Bruijn F.J. Characterization of the diversity of ecological important microbes by rep PCR genomic fingerprinting. In: Molecular microbial ecologymanual, second edition. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2004, Chapter 5.3.2: 1-33.
Baldy Chudzik K. Rep PCR a variant to RAPD or an independent technique of bacteria genotyping? A comparison of the typing properties of rep PCR with other recognised methods of genotyping of microorganisms. Acta Microbiol. Pol., 2001, 50(3 4): 89 204.
Hu lton C.S.J., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli , Salmonella typhimurium and other enteric bacteria. Molecular M icrobiology , 1991, 5 ( 4): 825 834 (doi: 10.1111/j.1365 2958.1991.tb00755.x)
Versalovic J., Koeuth T., Lupski R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research , 1991, 19(24): 6823 6831 (doi: 10.1093/nar/19.24.6823).
Martin B.., Humbert O.., Camara M.., Guenzi E.., Walker J.., Mitchell T.., Andrew P.., dhomme M.., Alloing G.., Hakenbeck R.., Morrison А D.., Boulnois G J.., Claverys J P. A h ighly conserved repeated DNA element located in the chromosome of Streptococcus pneumoniae Nucleic Acids Research 1992, 20 ( 3479 3483 doi: 10.1093/nar/20.13.3479)
Villa A.L. V.V., Arag Aragão M.R. S.S., dos Santos E.P., Mazotto A.M., Zingali R.B., de Souza E.P., Vermelho A.B. Feather keratin hydrolysates obtained from microbial keratinases: effect on hair fiber. BMC B iotechnology , 2013, 13: 15 (doi: 10.1186/1472 67501315

Еще

Статья научная