ДНК-технологии. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Эффективность РНК-интерференции (РНКи) в подавлении транскрипционной активности генов-мишеней у насекомых-вредителей, фитопатогенных вирусов и грибов определяет интерес к биосинтезу двуцепочечной РНК (дцРНК) в бактериях Escherichia coli как менее затратной технологии по сравнению с синтезом in vitro. Упрощение процедуры выделения дцРНК из бактерий может снизить затраты на производство дцРНК и способствовать расширению применения РНКи в защите растений. В представленной работе впервые разработана достаточно простая и эффективная методика выделения и очистки дцРНК из бактериальной культуры Escherichia coli для дальнейшего изучения возможностей ее использования в сельскохозяйственной практике. Нашей целью было конструирование оригинального вектора для эффективной экспрессии молекул дцРНК в бактериях Escherichia coli HT115(DE3), а также оптимизация условий выделения нуклеиновых кислот из бактериальных клеток, обработки экстрактов РНКазой А и последующего выделения дцРНК с использованием кислого фенола. При создании нового вектора для получения дцРНК в бактериях E. coli HT115(DE3) мы использовали плазмиду pRSETа («Thermo Fisher Scientific», США) без участка, кодирующего N-концевой рекомбинантный таг. Чтобы встроить дополнительный промотор Т7 в состав вектора, плазмиду реамплифицировали с прямым праймером 5´-ССCTATAGTGAGTCGTATTAgaaaggaagctgagttggctgctg-3´ (промотор Т7 подчеркнут) и обратным 5´-CTTTGTTAGCAGCCGGATCAAG-3´, а также смесью для ПЦР Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix («Thermo Fisher Scientific», США). Фосфорилирование концов ПЦР-продукта и их лигирование с помощью T4 полинуклеотидкиназы и Т4 ДНК-лигазы («Thermo Fisher Scientific», США) позволили получить оригинальный вектор для экспрессии дцРНК в бактериях. Для биосинтеза дцРНК в E. coli были использованы фрагменты генов, кодирующих субъединицу beta'-COP коатомерного комплекса колорадского жука Leptinotarsa decemlineata , одну из эндонуклеаз зеленой персиковой тли Myzus persicae , а также встроенные в один полилинкер фрагменты генов субъединицы А вакуолярной АТФазы, субъединицы 7 (Mov34) 26S протеасомы и актина L. decemlineata . Сконструированные плазмиды вводили в клетки E. coli HT115(DE3) с помощью электропоратора 2510 («Eppendorf», Германия) при 1700 В. Встраивание в новый вектор фрагментов генов L. decemlineata и M. persicae , последующая трансформация бактерий E. coli HT115(DE3) созданными конструкциями, экспрессия и выделение молекул дцРНК продемонстрировали высокую эффективность их биосинтеза, сравнимую с таковой для традиционного вектора L4440. Оптимизация условий экстракции нуклеиновых кислот из бактериальных клеток для последующей обработки экстрактов РНКазой А показала эффективность обработки ультразвуком, а также прогревания в воде при 95 °С. Для удаления одноцепочечной РНК оптимальным оказалось присутствие в реакционной смеси 0,4 М NaCl и 1,25 мкг фермента РНКазы А («Thermo Fisher Scientific», США) на 1 мл реакционной смеси. Обработка реакционной смеси кислым фенолом (рH 4,0), а затем хлороформом необходимы не только для избирательной экстракции дцРНК, но и для инактивации стабильной РНКазы А. Обработка реакционной смеси только хлороформом не приводила к полной инактивации фермента. Количество дцРНК, выделенной из бактерий, которые были обработаны ультразвуком перед инкубацией с РНКазой А, при подобранных нами условиях и использованном оборудовании составило 9,1±1,2 мкг/мл культуры, что оказалось соизмеримым с результатами более сложного метода экстракции, основанного на прогревании с детергентом додецилсульфатом натрия и последующей фенол-хлороформной экстракции (8,8±0,6 мкг/мл культуры). При прогревании бактерий в течение 20 мин в воде при 95 °С перед инкубацией с РНКазой А выход дцРНК составил приблизительно 55 % от значений, наблюдаемых при использовании двух других методов (5,0±1,5 мкг/мл культуры).
Бесплатно
Статья научная
Использование препаратов на основе безопасных для окружающей среды белковых элиситоров устойчивости растений к болезням может стать приемлемой альтернативой синтетическим пестицидам-ксенобиотикам, поскольку в естественных условиях такие элиситоры разлагаются до безвредных природных аминокислот. Этот подход также существенно снизит риск возникновения резистентности патогенов к средствам защиты растений. Ранее нами были выделены и исследованы бактериальные белки-элиситоры MF2 и MF3, способные индуцировать защитные реакции у широкого круга растений к вирусным и грибным патогенам. Белок MF2 размером 7,2 кДа выделен из Bacillus thuringiensis . Его первичная структура оказалась в высокой степени гомологичной аминокислотной последовательности бактериальных белков холодового шока CspD. Другой белок, MF3 (16,9 кДа) - пептидил-пролил цис/транс-изомераза FKBP типа, выделен из Pseudomonas fluo-rescens . В настоящей работе впервые был получен состоящий из двух элиситоров химерный белок MF2/MF3 и показана его защитная активность в патосистеме табак ( Nicotiana tabacum L.)-вирус табачной мозаики (ВТМ, семейство Virgaviridae , род Tobamovirus , вид Tobacco mosaic virus ). Также впервые установлено, что защитная активность MF2/MF3 не уступает активности смеси индивидуальных белков, взятых в эквивалентных концентрациях. Нашей целью было получение химерного белка MF2/MF3 методом гетерологичной экспрессии в Escherichia coli , оценка его способности индуцировать устойчивость к вирусу табачной мозаики, а также сравнение защитной активности полученного рекомбинантного элиситора с активностью индивидуальных элиситорных белков MF2 и MF3 и их смеси. Белок MF2/MF3, представлявший собой структуру из двух доменов, в которой элиситор MF2 был присоединен к N-концевому участку MF3 через полиаланиновый линкер (AAALIAA), получили на основе конструкции, созданной с использованием классической и Overlap-ПЦР. Рекомбинантный MF2/MF3 экспрессировался трансформированными клетками Escherichia coli Rosetta в виде растворимого белка массой около 25 кДа и был очищен до гомогенного состояния методом металл-аффинной хроматографии. Для оценки антивирусной активности химерного белка MF2/MF3 и сравнения его защитного эффекта с эффектом индивидуальных белков и их смеси использовали биотест с прединокуляционной обработкой отделенных от растения листьев табака некрозообразующего сорта Xanthi NN, которые затем заражали ВТМ. Растения выращивали в климатической камере (PGV 36, «Conviron», Канада) до стадии 3-5 настоящих листьев, в опытах использовали листья 3-го или 4-го яруса. Перед инокуляцией изолированные листьев обрабатывали препаратами химерного MF2/MF3 белка, индивидуальных белков (либо MF2, либо MF3) или их смеси. При этом на одну половинку листа наносили указанные препараты (5 капель по 10 мкл, 10 листьев на каждый вариант обработки), на другую половинку - соответствующий контроль. На следующий день листья инокулировали ВТМ. В первой серии экспериментов проверяли, сохранили ли препараты, полученные с помощью гетерологичной экспрессии свою целевую активность. Поэтому на половинки листьев наносили белки MF2/MF3, MF2, или MF3, а контрольные половинки листьев обрабатывали дистиллированной водой. Во второй серии опытов, целью которых было сравнение защитной активности химерного элиситора с каждым из индивидуальных элиситорных белков, на одну половинку листа наносили MF2/MF3, на вторую - MF2 или MF3. Наконец, в третьей серии экспериментов сравнивали защитный эффект химерного элиситора MF2/MF3 с эффектом смеси MF2 и MF3 после обработки половинок листьев MF2/MF3 и нанесения на их контрольные половинки смеси элиситорных белков. Кроме того, в каждую серию экспериментов включали вариант, в котором на обе половинки 5 листьев наносили капли дистиллированной воды, после чего листья заражали ВТМ (необработанный контроль). Было показано, что полученный химерный элиситор а также рекомбинантные MF2 и MF3 обладает высокой защитной активностью против ВТМ. При этом противовирусная активность элиситора MF2/MF3 приблизительно в 1,5 раза превышала активность каждого из белков. Сравнение уровней защитного эффекта смеси индивидуальных элиситоров и белка MF2/MF3 не выявило между ними статистически значимых различий. Таким образом, химерный MF2/MF3 обладал такой же целевой активностью, как и смесь MF2 и MF3. Эти результаты свидетельствуют о возможности использования вместо смеси элиситоров MF2 и MF3 рекомбинантного элиситора MF2/MF3, получение которого более технологично, чем приготовление смеси, требующее выращивания штаммов-продуцентов каждого из индивидуальных белков и их раздельного выделения.
Бесплатно
