Ветеринарная санитария и диагностика. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Кишечные инфекции наносят существенный вред животноводству. Среди паразитарных инфекций наиболее остро эта проблема стоит для криптоспоридиоза. Мониторинг и своевременная диагностика способны существенно снизить заболеваемость криптоспоридиозом среди новорожденных телят. Известно, что молекулярные методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладают высокой чувствительностью, однако при диагностике паразитарных инфекций неэффективная пробоподготовка способна нивелировать это преимущество. В настоящей работе впервые в России мы провели сравнительный анализ различных методов выделения ДНК из фекалий и выбрали оптимальный - с предварительным измельчением образцов мелющими гранулами (bead-beating) и экстракцией ДНК на колонке. Выбранный способ лег в основу разработанной методики диагностики криптоспоридиоза с использованием ПЦР в реальном времени, которая по чувствительности не уступает методам микроскопии. Нашей целью стала разработка метода ПЦР-диагностики криптоспоридиоза, ее апробация на образцах биологического материала от животных и сравнение результатов, полученных этим методом и классическими микроскопическими методами. Образцы фекалий телят голштинской породы были собраны в 2023 году в хозяйствах Вологодской области. Сбор образцов проводили после вспышки криптоспоридиоза в период лечения. Всего было собрано 20 образцов. Образцы фекалий отбирали непосредственно из прямой кишки животного в чистую емкость, каждый образец делили на две пробы, одну из которых использовали для микроскопического исследования по стандартному протоколу, а вторую направляли для ПЦР-исследования, предварительно поместив ее в 70 % раствор этилового спирта для консервации. Для обнаружения криптоспоридий в пробах кала использовали набор для окрашивания по Цилю-Нильсену Диахим (НПФ «Абрис+», Россия). Микроскопию проводили с увеличением ×1000 с масляной иммерсией (световой микроскоп Olympus cx33, «Olympus», Япония). По числу выделенных ооцист в расчете на 1 г фекалий определяли степень инвазированности животных. Для разработки тест-системы на основе ПЦР были выбраны специфические олигонуклеотидные праймеры Crypt-F 5´-TAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGA-3´, Crypt-R 5´-GAGTAAGGAACAACCTCCAATCT-3´, флуоресцентный зонд Crypt-P R6G-5´-ATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGA-3´-BHQ1 в области гена 18S рРНК, позволяющие выявлять все виды Cryptosporidium . Для пробоподготовки образцов кала применяли различные протоколы, включающие использование стандартных концентраторов ГЕМ (ООО «ГЕМ», Россия), концентраторов ГЕМ без формалина или предусматривающие промывку биообразцов фосфатным буфером без концентрирования. После пробоподготовки для экстракции ДНК из осадка кала использовали набор QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit («QIAgen», Германия), включающий стадию очистки ДНК на спин-колонках. Для выделения ДНК из надосадочной фракции осветленного экстракта фекалий, полученной при пробоподготовке по МУ 1.3.2569-09, использовали набор АмплиТест РИБО-преп (ФГБУ ЦСП ФМБА, Россия), позволяющий получить очищенную ДНК методом спиртового осаждения. Мы не выявили преимуществ пробоподготовки с использованием концентраторов ГЕМ, а пробоподготовка в присутствии формалина негативно сказывалась на результатах ПЦР. Получение надосадочной фракции осветленного экстракта с последующей экстракцией ДНК набором АмплиТест РИБО-преп также не позволяло эффективно выделять ДНК Cryptosporidium из-за высоких потерь ооцист в осадочной фракции кала. Эффективными для пробоподготовки биоматериала и экстракции паразитарной ДНК оказались протоколы, предполагающие экстракцию ДНК из цельного кала с механическим дроблением и последующей очисткой ДНК на спин-колонках. Механическое дробление образцов кала твердыми гранулами в пробирках проводили на гомогенизаторе TissueLyser LT («QIAgen», Германия), при этом происходили как гомогенизация материала, облегчающая последующие этапы очистки ДНК, так и разрушение клеток, включая паразитарные, для полного высвобождения нуклеинового материала. По результатам сравнительного эксперимента ооцисты Cryptosporidium spp. были обнаружены методом микроскопии в 15 из 20 проб, причем четыре из 15 положительных образцов имели крайне низкое их содержание, единичные ооцисты. При использовании наилучшего способа пробоподготовки и экстракции ДНК в ПЦР с использованием собственной методики также 15 образцов из 20 были определены как положительные. Для образцов с высоким и умеренным содержанием ооцист криптоспоридий результаты, полученные методом ПЦР, полностью совпали с данными микроскопии. Для двух образцов с низким содержанием ооцист результаты микроскопии и ПЦР расходились: методом ПЦР один образец был определен как слабоположительный (Ct > 40), хотя микроскопия показала отрицательный результат, и наоборот, второй образец, слабоположительный методом микроскопии («+»), был определен как отрицательный методом ПЦР.
Бесплатно
Статья научная
В связи с устойчивым ростом российского птицеводства проблема микробиологической безопасности продукции приобретает исключительное значение. Особый контроль требуется в отношении патогенов Salmonella spp., Campylobacter spp. и Listeria monocytogenes , способных вызывать пищевые отравления, при этом перекрестная контаминация с объектов производственной среды птицеперерабатывающих комплексов представляет собой ключевой риск выпуска опасной продукции. Опасность усугубляет передача через производственную среду патогенов, обладающих резистентностью к антибиотикам. В настоящей работе впервые была установлена сезонно-зональная специфика контаминации абиотических объектов патогенными микроорганизмами на птицеперерабатывающем предприятии, выявлена максимальная вероятность обнаружения Campylobacter spp., Salmonella spp. и Listeria monocytogenes в грязной и чистой зонах предприятия в летний период и межсезонье, доминирование Campylobacter jejuni среди патогенов (83 % случаев) и установлена их локализация на оборудовании зон убоя и охлаждения. Показано статистически достоверное снижение факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) только в чистой зоне относительно грязной и промежуточной. Показан сезонный дисбаланс: максимальные значения КМАФАнМ было зарегистрировано в межсезонье, тогда как пик выявляемости патогенов пришелся на лето. Цель работы - определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов на абиотических объектах производственной среды в зависимости от сезона и выявление патогенных микроорганизмов, чувствительных к антибиотикам. Образцы на птицеперерабатывающем производстве (Московская обл.) были отобраны в разное время года: лето (конец августа 2021 года), зима (конец февраля 2021 года) и межсезонье, осень (конец сентября 2020 года). Методика исследования включала отбор 72 смывов в середине рабочей смены с 12 абиотических объектов, не контактирующих с продукцией, расположенных в грязной, промежуточной и чистой зонах. Детекцию патогенов проводили методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) на приборе 3M MDS («3М», США) с последующим микробиологическим подтверждением положительных результатов в соответствии с ГОСТ. Чувствительность выделенных изолятов к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом в соответствии с рекомендациями CLSI и EUCAST. Количественный учет КМАФАнМ осуществляли посевом на агар PCA с инкубацией при 30 °C в течение 72 ч. Учитывая ненормальность распределения полученных данных (d = 0,47 > d* = 0,20, критерий Смирнова-Колмогорова), статистический анализ проводили с использованием непараметрических методов: рангового двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Дункана для множественного сравнения при уровне значимости a = 0,1. В результате исследования впервые была установлена сезонно-зональная специфика контаминации. Вероятность обнаружения хотя бы одного патогена составила 33 %, при этом по ходу производственного процесса она распределилась как 42 % (грязная зона), 17 % (промежуточная зона) и 42 % (чистая зона), а в зависимости от сезонности - 50 % (лето), 42 % (межсезонье) и 8 % (зима). Ранжирование патогенов по вероятности выявления показало доминирование Campylobacter spp. (17 %), затем Listeria monocytogenes (14 %) и Salmonella spp. (11 %). Campylobacter jejuni преимущественно детектировались в зоне убоя и первичной обработки, Salmonella spp. обнаруживались во всех зонах, включая чистую, а Listeria monocytogenes доминировали в зоне финишной обработки и упаковки. Все штаммы Salmonella spp. проявили резистентность к налидиксовой кислоте, ряд штаммов также показали устойчивость к ко-тримоксазолу, моксифлоксацину, сульфаметоксазолу, тетрациклину. Выявлен атипичный профиль резистентности у штамма Salmonella S_1, проявившего избирательную устойчивость к моксифлоксацину при сохранении чувствительности к другим фторхинолонам, что может быть связано с накопленными мутациями в генах или плазмидах. Анализ антибиотикочувствительности Listeria monocytogenes выявил ограниченную устойчивость, проявлявшуюся преимущественно к цефтазидиму и тетрациклину. При этом один из пяти штаммов оказался чувствительным ко всем антимикробным препаратам, а мультирезистентные фенотипы обнаружены не были. Штаммы бактерий рода Campylobacter проявляли устойчивость к ципрофлоксацину, эритромицину и тетрациклину. Часть исследованных изолятов были определены как мультирезистентные. При оценке КМАФАнМ было показано статистически достоверное снижение показателя только в чистой зоне - (4,16±2,27)×104 КОЕ/см2 относительно грязной (5,23±1,95)×106 КОЕ/см2 и промежуточной (8,88±5,74)×105 КОЕ/см2 зон (р 6 КОЕ/см2 были зарегистрированы в межсезонье. Таким образом, полученные результаты комплексно характеризуют абиотические поверхности птицеперерабатывающих предприятий как скрытые резервуары патогенов и антибиотикорезистентных штаммов, демонстрирующие сложную сезонно-зональную динамику.
Бесплатно
