Распространение и антибиотикоустойчивость патогенных микроорганизмов на птицеперерабатывающем предприятии в зависимости от сезонности
Автор: Юшина Ю.К., Махова А.А., Зайко Е.В., Семенова А.А., Батаева Д.С., Некрасов Р.В.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Ветеринарная санитария и диагностика
Статья в выпуске: 4 т.60, 2025 года.
Бесплатный доступ
В связи с устойчивым ростом российского птицеводства проблема микробиологической безопасности продукции приобретает исключительное значение. Особый контроль требуется в отношении патогенов Salmonella spp., Campylobacter spp. и Listeria monocytogenes , способных вызывать пищевые отравления, при этом перекрестная контаминация с объектов производственной среды птицеперерабатывающих комплексов представляет собой ключевой риск выпуска опасной продукции. Опасность усугубляет передача через производственную среду патогенов, обладающих резистентностью к антибиотикам. В настоящей работе впервые была установлена сезонно-зональная специфика контаминации абиотических объектов патогенными микроорганизмами на птицеперерабатывающем предприятии, выявлена максимальная вероятность обнаружения Campylobacter spp., Salmonella spp. и Listeria monocytogenes в грязной и чистой зонах предприятия в летний период и межсезонье, доминирование Campylobacter jejuni среди патогенов (83 % случаев) и установлена их локализация на оборудовании зон убоя и охлаждения. Показано статистически достоверное снижение факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) только в чистой зоне относительно грязной и промежуточной. Показан сезонный дисбаланс: максимальные значения КМАФАнМ было зарегистрировано в межсезонье, тогда как пик выявляемости патогенов пришелся на лето. Цель работы - определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов на абиотических объектах производственной среды в зависимости от сезона и выявление патогенных микроорганизмов, чувствительных к антибиотикам. Образцы на птицеперерабатывающем производстве (Московская обл.) были отобраны в разное время года: лето (конец августа 2021 года), зима (конец февраля 2021 года) и межсезонье, осень (конец сентября 2020 года). Методика исследования включала отбор 72 смывов в середине рабочей смены с 12 абиотических объектов, не контактирующих с продукцией, расположенных в грязной, промежуточной и чистой зонах. Детекцию патогенов проводили методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) на приборе 3M MDS («3М», США) с последующим микробиологическим подтверждением положительных результатов в соответствии с ГОСТ. Чувствительность выделенных изолятов к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом в соответствии с рекомендациями CLSI и EUCAST. Количественный учет КМАФАнМ осуществляли посевом на агар PCA с инкубацией при 30 °C в течение 72 ч. Учитывая ненормальность распределения полученных данных (d = 0,47 > d* = 0,20, критерий Смирнова-Колмогорова), статистический анализ проводили с использованием непараметрических методов: рангового двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Дункана для множественного сравнения при уровне значимости a = 0,1. В результате исследования впервые была установлена сезонно-зональная специфика контаминации. Вероятность обнаружения хотя бы одного патогена составила 33 %, при этом по ходу производственного процесса она распределилась как 42 % (грязная зона), 17 % (промежуточная зона) и 42 % (чистая зона), а в зависимости от сезонности - 50 % (лето), 42 % (межсезонье) и 8 % (зима). Ранжирование патогенов по вероятности выявления показало доминирование Campylobacter spp. (17 %), затем Listeria monocytogenes (14 %) и Salmonella spp. (11 %). Campylobacter jejuni преимущественно детектировались в зоне убоя и первичной обработки, Salmonella spp. обнаруживались во всех зонах, включая чистую, а Listeria monocytogenes доминировали в зоне финишной обработки и упаковки. Все штаммы Salmonella spp. проявили резистентность к налидиксовой кислоте, ряд штаммов также показали устойчивость к ко-тримоксазолу, моксифлоксацину, сульфаметоксазолу, тетрациклину. Выявлен атипичный профиль резистентности у штамма Salmonella S_1, проявившего избирательную устойчивость к моксифлоксацину при сохранении чувствительности к другим фторхинолонам, что может быть связано с накопленными мутациями в генах или плазмидах. Анализ антибиотикочувствительности Listeria monocytogenes выявил ограниченную устойчивость, проявлявшуюся преимущественно к цефтазидиму и тетрациклину. При этом один из пяти штаммов оказался чувствительным ко всем антимикробным препаратам, а мультирезистентные фенотипы обнаружены не были. Штаммы бактерий рода Campylobacter проявляли устойчивость к ципрофлоксацину, эритромицину и тетрациклину. Часть исследованных изолятов были определены как мультирезистентные. При оценке КМАФАнМ было показано статистически достоверное снижение показателя только в чистой зоне - (4,16±2,27)×104 КОЕ/см2 относительно грязной (5,23±1,95)×106 КОЕ/см2 и промежуточной (8,88±5,74)×105 КОЕ/см2 зон (р 6 КОЕ/см2 были зарегистрированы в межсезонье. Таким образом, полученные результаты комплексно характеризуют абиотические поверхности птицеперерабатывающих предприятий как скрытые резервуары патогенов и антибиотикорезистентных штаммов, демонстрирующие сложную сезонно-зональную динамику.
Смывы, salmonella spp, campylobacter spp, listeria monocytogenes, кмафанм, антибиотикорезистентность
Короткий адрес: https://sciup.org/142246216
IDR: 142246216 | УДК: 619:614.36:579.63 | DOI: 10.15389/agrobiology.2025.4.739rus
Seasonal patterns and antibiotic resistance of pathogenic microorganisms at a poultry processing plant
Due to the steady growth of the Russian poultry industry, the problem of microbiological safety of products is of exceptional importance Special control is required for the pathogens Salmonella spp., Campylobacter spp. and Listeria monocytogenes, which can cause food poisoning, while cross-contamination from poultry processing facilities is a key risk for the release of dangerous products. The danger is increased by the transmission of antibiotic-resistant pathogens in the production environment. This study is the first to establish the seasonal and zonal specificity of pathogenic microorganism contamination on abiotic surfaces within a poultry processing facility. It detected the highest probability of detecting Campylobacter spp., Salmonella spp., and Listeria monocytogenes in both the dirty and clean zones of the plant during the summer and shoulder seasons, the dominance of Campylobacter jejuni among the pathogens (83 % of cases). Their localization was identified on equipment in the slaughter and cooling zones. A statistically significant reduction total number of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms (Total Viable Count, TVC) was demonstrated only in the clean zone compared to the dirty and intermediate zones. A seasonal imbalance was shown: maximum TVC values were recorded during the shoulder season, while the peak detection of pathogens occurred in summer. The aim of the work was to study the total number of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms on abiotic objects in the production environment depending on the season and to identify pathogenic microorganisms sensitive to antibiotics. Samples at the poultry processing plant (Moscow Province) were collected at different times of the year: summer (end of August 2021), winter (end of February 2021), and the shoulder season, autumn (end of September 2020). The research methodology involved collecting 72 swabs in the middle of the work shift from 12 abiotic surfaces not in contact with the product, located in the dirty, intermediate, and clean zones. Pathogen detection was carried out using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) on a 3M MDS device (3M, USA) followed by microbiological confirmation of positive results in accordance with GOST. The sensitivity of the isolated isolates to antimicrobial drugs was determined by the disk diffusion method according to CLSI and EUCAST recommendations. Quantitative accounting of TVC/APC was performed by plating on PCA agar with incubation at 30 °C for 72 hours. Given the non-normal distribution of the obtained data (d = 0.47 > d* = 0.20, Smirnov-Kolmogorov test), statistical analysis was performed using non-parametric methods: two-factor rank analysis of variance and Duncan's test for multiple comparisons at a significance level of a = 0.1. As a result of the study, the seasonally-dependent and zone-specific nature of contamination was established for the first time. The probability of detecting at least one pathogen was 33 %, distributed as 42 % (dirty zone), 17 % (intermediate zone), and 42 % (clean zone) along the production process, and depending on seasonality - 50 % (summer), 42 % (shoulder season), and 8 % (winter). The probability of detecting at least one pathogen was 33%, while during the production process it was distributed as 42 % (dirty zone), 17 % (intermediate zone) and 42 % (clean zone), and depending on the seasonality - 50 % (summer), 42 % (off-season) and 8 % (winter). The ranking of pathogens by probability of detection showed the dominance of Campylobacter spp. (17 %), followed by Listeria monocytogenes (14 %) and Salmonella spp. (11 %). Campylobacter jejuni was mainly detected in the slaughter and primary treatment area. Salmonella spp. were found in all zones, including the clean one, and Listeria monocytogenes was concentrated in the finishing and packaging zone. All Salmonella spp. strains exhibited resistance to nalidixic acid; a number of strains also showed resistance to co-trimoxazole, moxifloxacin, sulfamethoxazole, and tetracycline. An atypical resistance profile was identified in the Salmonella strain S_1 which showed selective resistance to moxifloxacin while remaining susceptible to other fluoroquinolones, which may be associated with accumulated mutations in genes or plasmids. Analysis of the antibiotic susceptibility of Listeria monocytogenes revealed limited resistance, manifested mainly to ceftazidime and tetracycline. One of the five strains was susceptible to all antimicrobials, and multidrug-resistant phenotypes were not detected. Strains of the genus Campylobacter exhibited resistance to ciprofloxacin, erythromycin, and tetracycline. Some of the studied isolates were identified as multidrug-resistant.
Текст научной статьи Распространение и антибиотикоустойчивость патогенных микроорганизмов на птицеперерабатывающем предприятии в зависимости от сезонности
Российская Федерация уверенно демонстрирует устойчивые темпы роста птицеводства. Производство мяса птицы в живой массе в промышленном секторе по итогам 2022 года превысило 6,5 млн т, что на 4,9 % выше показателя 2021 года (6,2 млн т) (1). Доля птицы в общем объеме производства мяса в России сегодня составляет почти 50 %.
Для внешнего и внутреннего потребления повышение безопасности мяса птицы имеет исключительное значение. В производстве мяса птицы сопутствующая микрофлора играет важную роль как с точки зрения обеспечения безопасности выпускаемой продукции, так и с позиций исключения ее порчи до окончания сроков годности (2). Особый контроль требуется в отношении присутствия микроорганизмов, вызывающих пищевые отравления, а также таких патогенных микроорганизмов, как Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria monocytogenes (3). Перекрестная контаминация с объектов производственной среды птицеперерабатывающих комплексов может становиться причиной выпуска потенциально опасной продукции (4).
Именно поэтому зарубежные публикации последних лет посвящены разработке различный стратегий контроля миграции патогенных микроорганизмов по всей цепи производства пищевых продуктов (5). Такие схемы отражают важность мониторинга патогенных бактерий как на пред-убойном этапе, в птичниках (контроль воды корма, подстилки, кишечных патогенов птицы), так и на послеубойном (взятие смывов на всех этапах переработки, удаление биопленок, применение эффективных дезинфицирующих средств, получение информации о микробиоме конкретного производства) (6). В зарубежной практике по результатам мониторинговых исследований разрабатываются новые руководства и инструкции для предприятий по снижению контаминации объектов производства наиболее значимыми патогенами. Так, в 2021 году служба безопасности и качества продуктов США (Food Safety and Inspection Service, FSIS) выпустила инструкции по контролю бактерий рода Campylobacter и бактерий рода Salmonella для малых птицеперерабатывающих предприятий (7, 8). К сожалению, в нашей стране подобных исследований мало. Кроме того, нет нормативной документации, регламентирующей определение патогенных микроорганизмов в рамках санитарно-микробиологического исследования объектов внешней среды предприятий.
На циркуляцию патогенных бактерий в производственной среде влияют гигиенический статус предприятий, внешние и внутренние факторы, включая сезонность (9). Влияние сезонности особенно актуально для нашей страны, где климат характеризуется четким разделением на теплые и холодные периоды года и иногда отсутствием плавной смены температуры.
Серьезную опасность представляет передача через производственную среду патогенных микроорганизмов, обладающих резистентностью к антибиотикам, приобретенной вследствие их нерационального примене-740
ния в ветеринарной и сельскохозяйственной практике (10). Передача с пищевой продукцией может приводить к быстрому распространению патогенных микроорганизмов с множественной резистентностью к различным препаратам и возникновению последующих затруднений при выборе антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний (11).
В связи с недостатком исследований на эту тему изучение микробиома производственной среды птицеперерабатывающих предприятий имеет важное значение для разработки мер повышения микробиологической безопасности мяса птицы.
В настоящей работе впервые установлена сезонно-зональная специфика контаминации абиотических объектов патогенными микроорганизмами на птицеперерабатывающем предприятии, выявлена максимальная вероятность обнаружения Campylobacter spp., Salmonella spp. и Listeria monocytogenes в грязной и чистой зонах предприятия в летний период и межсезонье, доминирование Campylobacter jejuni среди патогенов (83 % случаев) и установлена их локализация на оборудовании зон убоя и охлаждения. Выявлен атипичный профиль резистентности Salmonella S_1, показано статистически достоверное снижение факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) только в чистой зоне относительно грязной и промежуточной. Показан сезонный дисбаланс: максимальные значения КМАФАнМ было зарегистрировано в межсезонье, тогда как пик выявляемости патогенов пришелся на лето. Эти результаты впервые комплексно характеризуют скрытые резервуары патогенов и антибиотикорезистентных штаммов на абиотических поверхностях птицеперерабатывающих предприятий.
Целью работы было определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов на абиотических объектах производственной среды в зависимости от сезона и выявление патогенных микроорганизмов, чувствительных к антибиотикам.
Методика. Образцы отбирали на птицеперерабатывающем производстве (Московская обл.) в 12 точках в разное время года: лето (конец августа 2021 года), зима (конец февраля 2021 года) и межсезонье, осень (конец сентября 2020 года). Отбор проб проводили в середине смены. Для характеристики сезонных изменений погоды в Москве в эти периоды использовали данные сайта
Отбор образцов осуществляли в двух повторах. Для отбора проб было выбрано 12 объектов, находившихся в грязной, промежуточной и чистой зонах производственного процесса. Смывы со всех объектов (независимо от их типа — основное оборудование, вспомогательное оборудование, конструкции) делали с поверхностей, не контактирующих с пищевым сырьем и продукцией. Всего с учетом трех сезонов было собрано и исследовано 72 образца (смыва).
Отбор смывов осуществляли стерильными губками c летиновым бульоном («3М», США), а с труднодоступных мест — свабами (стерильными ватными тампонами) с летиновым бульоном («3М», США). Площадь смыва составляла около 100 см2 (для ровных поверхностей использовали стерильные рамки-трафареты).
Все образцы были изучены на наличие бактерий родов Salmonella, Campylobacter и вида Listeria monocytogenes. Исследования проводили методом, основанным на петлевой изотермической амплификации ДНК (LAMP) на приборе молекулярной диагностики 3M MDS («3М», США) с использованием праймеров, позволяющих распознать различные участки гена (мишени) бактерий. Бактерии вида L. monocytogenes выявляли с помощью набора 3M Molecular Detection Assay Listeria monocytogenes («3М», США), бактерии рода Salmonella spp. — 3M Molecular Detection Assay Salmonella («3М», США), бактерии рода Campylobacters spp. — 3M Molecular Detection Assay Campylobacter spp («3М», США).
Перед проведением ПЦР образцы были обогащены с помощью питательных сред. Для выявления Listeria monocytogenes губки заливали 225 см3 бульона, а тампоны — 10 см3 Фрейзера полуконцентрированного и инкубировали в термостате BD 240 («Binder», Германия) при 37,0±1,0 ° С в течение 24 ч. Для обнаружения бактерий рода Salmonella губки заливали 225 см3, тампоны — 10 см3 предварительно нагретой до 41,5±1,0 ° С забу-ференной пептонной воды и инкубировали при 41,5±1,0 ° С в течение 1824 ч. Для выявления бактерий рода Campylobacter губки заливали 25 см3, тампоны — 10 см3 среды обогащения для бактерий рода Campylobacter («3M», США) и инкубировали при 41,5±1,0 ° С в течение 22-26 ч. После инкубирования обогащенные пробы извлекали из термостата и переносили по 0,02 мл в специальные пробирки для лизиса, входящие в состав каждого набора. Лизис проводили в нагревательным блоке Dry Block Heater 2 («IKA», Германия) при 100±1 ° С в течение 15±1 мин. Каждая процедура проведения лизиса включала отрицательный контроль, в который вместо образца вносили питательную среду, используемую для первичного обогащения. По завершении лизиса и охлаждения пробирок при комнатной температуре в течение 10 мин из верхней части лизис-пробирки образец объемом 0,02 мл переносили в пробирки с реагентами для ПЦР, входящие в состав набора. Каждая постановка ПЦР включала положительные и отрицательные контроли, входившие в состав наборов. Пробирки помещали в прибор 3M MDS («3M», США) и следовали инструкции производителя. Положительные результаты молекулярного анализа подтверждали проведением стандартных лабораторных исследований в соответствии с ГОСТ 31659 (ISO 6579:2002) (М., 2014), ГОСТ 32031 (М., 2014) и ГОСТ ISO 10272-1-2013 (М., 2013).
Для оценки чувствительности к антибиотикам бактерий Salmonella spp. использовали следующие диски: моксифлоксацин, 5 мкг (MX 5), сульфаметаксол/триметоприм, 25 мкг («Oxoid», Великобритания); линко-мицин, 15 мкг (ЛИНК) (ООО «НИЦФ», Россия); норфлоксацин, 10 мкг (NX10), ципрофлоксацин, 5 мкг (CIP 5), тетрациклин, 30 мкг (TE 30), имипенем, 10 мкг (IPM 10), меропенем, 10 мкг (MRP 10), тобрамицин, 10 мкг (TOB 10), амикацин, 30 мкг (AK 30), стрептомицин, 10 мкг (S 10), цефепим, 30 мкг (CPM 30), цефтриаксон, 30 мкг (CTR 30), эритромицин, 15 мкг (E 15), азитромицин, 15 мкг (AZM 15), хлорамфеникол, 30 мкг (С 30), налидиксовая кислота, 30 мкг (NA 30) («Himedia», Индия).
Чтобы определить чувствительность к антибиотикам бактерий Listeria monocytogenes использовали моксифлоксацин, 5 мкг (MX5) («Oxoid», Великобритания), амикацин, 30 мкг (AK 30), ампициллин, 10 мкг (AMP 10), азитромицин, 15 мкг (AZM 15), хлорамфеникол, 30 мкг (С 30), цефтазидим, 30 мкг (CAZ 30), ципрофлоксацин, 5 мкг (CIP 5), эритромицин, 15 мкг (E 15), имипенем, 10 мкг (IPM 10), меропенем, 10 мкг (MRP 10), норфлоксацин, 10 мкг (NX10), пенициллин G, 1 iu (P 1), тетрациклин, 30 мкг (TE 30) («Himedia», Индия).
Для оценки чувствительности к антибиотикам бактерий Campylobacter spp. использовали эритромицин, 15 мкг (E 15), налидиксовую кислоту, 30 мкг (NA 30), тетрациклин, 30 мкг (TE 30), ципрофлоксацин, 5 мкг (CIP 5), ампициллин, 10 мкг (AMP 10) («Himedia», Индия).
Результаты интерпретировали на основании измерения зон задержки роста. Степень устойчивости определяли в соответствии с положениями Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI (M100ed31) и EUCAST (12, 13). При интерпретации результатов чувствительности критерии устойчивости, отсутствующие в руководстве EUCAST, при оценке Listeria monocytogenes были дополнены критериями, рекомендованными для Staphylococcus aureus , Enterococcus spp. по стандартам CLSI (12), при оценке Campylobacter spp. для амоксициллина использовали контрольные точки EUCAST для Enterobacteriaceae .
Изоляты, устойчивые к трем и более представителям различных классов антимикробных препаратов, были определены как мультирези-стентные.
Для определения КМАФАнМ из образцов (смывов) делали ряд десятикратных разведений и проводили посев 1 мл на плотную питательную неселективную среду PCA (plate count agar, «Oxoid», Великобритания). Образцы инкубировали при 30 ° С в течение 72 ч, после чего подсчитывали выросшие колонии.
Статистический анализ проводили в пакете программ SPSS 20.0 («IBM», США) с использованием методов планирования эксперимента с применением двухфакторного дисперсионного анализа в рамках плана по типу 32. Фиксируемый фактор «зона» имел три порядковых уровня (1 — грязная зона, 2 — промежуточная зона, 3 — чистая зона), фиксируемый фактор «сезон» — три номинативных уровня (1 — межсезонье, 2 — зима, 3 — лето). Метод статистического анализа выбирали после проведения теста на нормальность и гомоскедастичность. Тест на нормальность про- водили с использованием критерия Смирнова-Колмогорова, тест на го-москедастичность — с помощью критерия Кохрана, но только после теста на нормальность. В случае отклонения нуль-гипотезы соответствующих критериев анализ данных продолжали с помощью непараметрических методов, в частности рангового двухфакторного дисперсионного анализа. В случае отклонения нуль-гипотезы по фиксируемым факторам анализ осуществляли методом множественного сравнения. Если было допустимо применение методов параметрического исследования, то в качестве критерия множественного сравнения средних использовали критерий Тьюки. Если использовали непараметрический анализ, тогда в качестве критерия множественного сравнения применяли критерий Дункана. Уровень значимости вычисляли при оптимальном уровне рассчитанного значения ошибки второго рода, оценки точности, коэффициента вариации при фиксированной мощности объединенной выборки.
Резуёьтаты. Характеристика погодных условий в выбранные для исследования периоды приведена в таблице 1.
1. Среднемесячные значения температуры и влажности воздуха в периоды проведения сезонных исследований (г. Москва)
|
Период |
Среднемесячная температура воздуха, ° С |
Диапазон среднесуточной температуры, ° С |
Среднемесячная влажность воздуха, % |
|
Сентябрь 2020 года |
+ 11,9 |
+9....+14 |
80 |
|
Февраль 2021 года |
- 6,2 |
- 8.. - 1 |
81 |
|
Август 2021 года |
+ 17,8 |
+ 15.+21 |
75 |
На момент первого отбора образцов микрофлора предприятия сформировалась под влиянием достаточно теплого сентября 2020 года, в зимний период — умеренно низких отрицательных температур февраля, которые продержались до 13 марта 2021 года, а в летний период — нежаркого и достаточно комфортного по температуре августа 2021 года.
При выборе объектов производственной среды и мест смывов (отбора образцов) в каждой зоне исходили из наличия труднодоступных участков для санитарной обработки (табл. 2).
2. Точки отбора смывов в производственной среде птицеперерабатывающего предприятия (Московская обл.)
|
Зона |
Участок |
Температура воздуха в помещении, ° С |
Объект производственной среды |
Номер объекта |
|
Грязная зона |
Убой птицы и |
+ 20±2 |
Машина для перенавески тушек |
№ 1 |
|
(ГЗ) |
первичная обра- |
Стена цеха |
№ 2 |
|
|
ботка тушек |
Внутрицеховая тара |
№ 3 |
||
|
Колесо тележки |
№ 4 |
|||
|
Промежуточная Охлаждение |
- 1±1 |
Туннель охлаждения |
№ 5 |
|
|
зона (ПЗ) |
тушек и субпро- |
Цепь конвейера |
№ 6 |
|
|
дуктов |
Ванна охлаждения |
№ 7 |
||
|
Стена цеха |
№ 8 |
|||
|
Чистая зона |
Разделка тушек и |
+ 10±2 |
Стол доработки тушек |
№ 9 |
|
(ЧЗ) |
упаковка |
Цепь под машиной удаления кости из бедра |
№ 10 |
|
|
Машина удаления кости из бедра |
№ 11 |
|||
|
Конвейерная лента |
№ 12 |
|||
На всех этапах производства, от грязной зоны к чистой, отмечалась контаминация объектов производственной среды патогенными микроорганизмами родов Salmonella , Campylobacter и Listeria monocytogenes (табл. 3). Бактерии рода Campylobacter были выявлены в грязной зоне 4 раза на поверхности двух объектов, а также на двух объектах промежуточной зоны. Все бактерии рода Campylobacter относились к виду Campylobacter jejuni и были обнаружены главным образом летом или в межсезонье (83 % всех случаев).
3. Сезонное распределение патогенных микроорганизмов на абиотических объектах птицеперерабатывающего предприятия (Московская обл.)
|
Зона |
Номер объекта |
Campylobacter spp. |
Salmonella spp. |
Listeria monocytogenes |
|
межсезонье | зима | лето |
межсезонье | зима | лето |
межсезонье | зима | лето |
|
ГЗ |
№ 1 |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
№ 2 № 3 № 4 |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
||
|
ПЗ |
№ 5 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
№ 6 |
+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
|
|
№ 7 № 8 № 9 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
ЧЗ |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
|
|
№ 10 |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
+ |
|
|
№ 11 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
|
|
№ 12 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Примечание. «+» — положительный результат, « - » — отрицательный результат; ГЗ — грязная зона,
ПЗ — промежуточная зона, ЧЗ — чистая зона. Описание объектов см. табл. 2.
Четыре случая выявления бактерий рода Salmonella были связаны с объектами всех трех зон производства, причем два из них — с объектами чистой зоны. Все случаи приходились на межсезонье и лето.
Микроорганизмы рода Listeria monocytogenes были выделены 5 раз, при этом 4 раза случаи выявления были связаны с объектами чистой зоны и только 1 случай — с объектом промежуточной зоны. Обнаружение Listeria monocytogenes во всех случаях приходилось на межсезонье и лето.
Вероятность выявления патогенных микроорганизмов (хотя бы одного из трех выше названных) в смывах с поверхности производственных объектов составила 33 %, что представляло высокий риск, связанный с их распространением в производственной среде и с переносом на пищевую продукцию. При этом вероятность выявления патогенных микроорганизмов по ходу производственного процесса составила 42, 17 и 42 % соответственно для грязной, промежуточной и чистой зон. Вероятность обнаружения патогенов в зависимости от сезонности составляла 50, 42 и 8 % соответственно для лета, межсезонья и зимы.
По вероятности выявления патогенные микроорганизмы были ранжированы в следующем порядке: на первом месте — Campylobacter spp. (вероятность выявления 17 %), на втором — Listeria monocytogenes (14 %), на третьем — Salmonella spp. (11 %).
Все штаммы бактерий рода Salmonella оказались резистентными к налидиксовой кислоте (табл. 4). Из 4 штаммов бактерий рода Salmonella 3 штамма показали резистентность к тетрациклину и сульфаметоксазолу. Кроме того, штаммы S_1, S_3, S_4 показали резистентность к целому пулу антимикробных веществ и были охарактеризованы как мультирезистент-ные.
4. Результаты оценки антибиотикорезистентности патогенных штаммов в смывах с поверхности абиотических объектов на птицеперерабатывающем предприятии (Московская обл., 2020-2021 годы)
|
Штамм | |
Фенотипический профиль резистентности |
Резистентность |
|
S 1 |
COT, MXF, NA, SXT, TE |
МР |
|
S 2 |
NA |
Р |
|
S 3 |
COT, NA, SXT, TE |
МР |
|
S 4 |
COT, NA, SXT, TE |
МР |
|
Lm 1 |
CAZ, TE |
Р |
|
Lm 2 |
CAZ |
Р |
|
Lm_3 |
CAZ, TE |
Р |
|
Lm_4 |
CAZ |
Р |
|
Lm_5 |
- |
- |
|
Camp_1 |
E, NA, TE |
МР |
Продолжение таблицы 4
Camp_2 CIP, TEP
Camp_3 E, NA, CIPP
Camp_4 CIP, TEP
Camp_5 NA, TEP
Camp 6 NA, TEP
Примечание. Прочерки означают, что указанный штамм был чувствителен ко всем исследованным антибиотикам. P — резистентный, MP — мультирезистентный. COT — ко-тримаксазол (25 мкг), MXF — моксифлоксацин (5 мкг), NA — налидиксовая кислота (30 мкг), P1 — пенициллин (1 iu), SXT — суль-фаметоксазоле/триметоприм (25 мкг), TE — тетрациклин (30 мкг), CAZ — цефазидим (30 мкг), CIP — ципрофлоксацин (5 мкг), E — эритромицин (15 мкг).
Только 2 из 5 штаммов L. monocytogenes обладали устойчивостью к тетрациклину и имели одинаковый фенотипический профиль (см. табл. 4). Один из исследованных штаммов L. monocytogenes был чувствителен ко всем исследуемым антибиотикам. Pезультатом анализа антибиотикоустой-чивости штаммов бактерий рода Campylobacter стало детектирование резистентности к ципрофлоксацину, эритромицину, тетрациклину и налидиксовой кислоте. Мультирезистентностью обладал 1 штамм.
5. Средние значения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) (КОЕ/см2) в смывах с поверхности объектов производственной среды ( n = 2, M ±SEM, Московская обл., 20202021 годы)
|
Зона |
Номер объекта |
Сезон |
Среднее значение КМАФАнМ для зоны |
||
|
межсезонье | |
зима |
лето |
|||
|
ГЗ |
№ 1 |
(5,0±1,0)х106 |
(9,0±0,0)х104 |
(5,4±0,1)х102 |
(5,23±1,95)х106 |
|
№ 2 |
(7,0±0,5)х106 |
(6,7±0,2)х102 |
(5,5±0,0)х103 |
||
|
№ 3 |
(7,0±0,0)х103 |
(2,0±0,0)х107 |
(2,4±0,1)х102 |
||
|
№ 4 |
(6,5±0,5)х105 |
(3,0±0,0)х107 |
(2,1±0,0)х104 |
||
|
ПЗ |
№ 5 |
(3,0±0,1)х103 |
(1,0±0,0)х107 |
(3,3±0,0)х103 |
(8,88±5,74)х105 |
|
№ 6 |
(4,0±0,0)х104 |
(6,0±1,0)х105 |
(1,1±0,1)х102 |
||
|
№ 7 |
(9,0±3,0)х10 1 |
(3,2±0,9)х102 |
(3,6±0,4)х102 |
||
|
№ 8 |
(9,0±0,0)х103 |
(5,0±0,1)х103 |
(1,6± 0,4)х10 1 |
||
|
4З |
№ 9 |
(5,0 ±1,0)х104 |
(4,0±0,0)х105 |
(1,1±0,1)х103 |
(4,16±2,27)х104 |
|
№ 10 |
(9,0±1,0)х103 |
(2,2±0,2)х102 |
(6,5±0,0)х102 |
||
|
№ 11 |
(3,0±0,1)х103 |
(1,8±0,1)х103 |
(1,7±0,0)х103 |
||
|
№ 12 |
(3,0±0,0)х104 |
(0,5±0,2)х10 1 |
(2,3±0,0)х103 |
||
|
Среднее значение |
|||||
|
КМАФАнМ для |
|||||
|
сезона |
(1,07±0,47)х106 |
(5,09±1,99)х106 |
(3,07±1,17)х103 |
||
Примечание. ГЗ — грязная зона, ПЗ — промежуточная зона, 43 — чистая зона. Описание объектов см. в таблице 2.
Средние значения КМАФАнМ для объектов производственной среды при переходе от зоны к зоне снижались примерно на 1 порядок и составили (5,23±1,95)х106, (8,88±5,74)х105 и (4,16±2,27)х104 КОЕ/см2 соответственно для объектов грязной, промежуточной и чистой зон (табл. 5).
Наименьшие значения КМАФАнМ для объектов производственной среды отмечали в летний период года — (3,07±1,17)х103. При этом в межсезонье и в зимний период средние значения КМАФАнМ возрастали на 3 порядка, составив соответственно (1,07±0,47)х106 и (5,09±1,99)х106 .
В целом, в середине смены объекты производственной среды характеризовались разным микробным загрязнением — от менее 101 КОЕ/см2 до более 107 КОЕ/см2.
Учитывая значительный разброс полученных данных, а также сложности, возникающие при анализе результатов микробиологических исследований (14), мы провели тест Смирнова-Колмогорова на нормальность распределения объединенной выборки и получили следующие результаты по оценке максимального рассогласования (d) с критическим значением (d*): d = 0,47, d* = 0,20, то есть d > d*. Следовательно, нуль-гипотеза была отклонена — распределение ненормально. В связи с этим для повышения надежности анализа были использованы непараметрические критерии — ранговый двухфакторный дисперсионный анализ в рамках плана 32 с использованием критерия Дункана при множественном сравнении в случае отклонения нуль-гипотезы. При оценке точности ф = 0,18, при ошибке второго рода (в) = 0,08, при коэффициенте вариации k = 0,57 и мощности выборки N = 72 оптимальный уровень значимости (а) составил 0,1. Далее после рангового кодирования данных провели ранговый двухфакторный дисперсионный анализ, по результатам которого было установлено, что существует достоверная межфакторная взаимосвязь между факторами «зона» и «сезон». Однако вычисленное значение р = 0,035 не позволяло рассматривать это межфакторное взаимодействие как существенное с точки зрения взаимовлияния фиксированных факторов. Также было установлено, что все фиксируемые факторы имели достоверный отклик, что указывало на значимость влияния факторов на зависимую переменную КМАФАнМ. Для установления значимости веса факторного воздействия на зависимую переменную в отношении факторов, имеющих достоверный статистический отклик, использовали метод z-трансформации Фишера с вычислением р для установления достоверности различий влияния вклада фактора на зависимую переменную. Результат р = 0,83, значительно превосходящий принятый уровень значимости, указывал на то, что по весу своего вклада оба фактора достоверно не различались. Далее для каждого фактора был проведен анализ множественного сравнения с использованием критерия Дункана. Результаты анализа данных с вычисленными р для фактора «зона» показали, что достоверно отличался только 3-й уровень (чистая зона) от 1-го и 2-го уровня (р < 0,05). При этом 1-й и 2-й уровни достоверно не различались (р > 0,1), то есть на объектах чистой зоны содержалось достоверно меньше микроорганизмов, чем на объектах грязной и промежуточной зон. Для фактора «сезон» было установлено, что достоверно отличался только 1-й уровень (межсезонье) от 2-го и 3-го уровня (р < 0,05). При этом 2-й и 3-й уровни не имели достоверных различий (р > 0,1). Следовательно, в межсезонье на объектах производственной среды имело место достоверно большее количество микроорганизмов по сравнению с летом и зимой.
Традиционные методы контроля санитарно-микробиологического состояния производства сводятся к анализу смывов с рук персонала, поверхностей оборудования и инвентаря, соприкасающихся с пищевым сырьем и пищевой продукцией. Абиотические объекты, не контактирующие с сырьем и продукцией, остаются без внимания. Кроме этого, взятие смывов проводят до начала работы либо после надлежащей обработки поверхностей. При этом бактериологическое исследование объектов внешней среды предусматривает определение лишь трех показателей: бактерий группы кишечной палочки (БГКП), Staphylococcus aureus и общего микробного числа. То есть существующая практика взятия смывов представляет собой лишь контроль мойки и дезинфекции основного технологического оборудования. В нашем исследовании акцент делался на выявлении патогенных микроорганизмов родов Campylobacter и Salmonella , а также Listeria monocytogenes — опасных возбудителей пищевых инфекций зоонозного происхождения (15).
Полученные в настоящей работе результаты по оценке распространенности патогенов в производственной среде хорошо согласуются с ранее опубликованными данными по их распространенности в сыром мясе птицы (16), где на первом месте была выделена проблема зараженности мяса бактериями рода Campylobacter (90,0 %), затем L. monocytogenes (58,3 %) и
Salmonella spp. (15,0 %). В таком же порядке патогены были проранжиро-ваны нами по вероятности выявления в производственной среде птицеперерабатывающего предприятия. Их циркуляция на предприятии в различные сезоны года как в грязной, так и в чистой зонах вызывает обеспокоенность относительно безопасности выпускаемой пищевой продукции, поскольку речь идет о микроорганизмах, способных вызывать инфекции, приводящие к летальному исходу (17).
Согласно данным литературы, очень часто убой и первичная переработка тушек птицы, особенно операции по снятию оперения и потрошению, становятся факторами риска распространения патогенных микроорганизмов и контаминации технологических поверхностей и оборудования (18). В нашем исследовании на этом участке сразу в двух образцах производственной среды (машина перенавески тушек и стена) были обнаружены бактерии рода Campylobacter . Результаты исследований показывают, что особенно важно контролировать загрязнения, возникающие при потрошении птицы, поскольку кишечник служит резервуаром для энтеро-патогенных бактерий рода Salmonella , E. coli и Campylobacter (19, 20).
При оценке поверхностей на наличие патогенных микроорганизмов бактерии рода Campylobacter также были обнаружены в зоне охлаждения. Это находит подтверждение в научных статьях. В исследовании зарубежных коллег, где изучали смывы с тушек птицы, была выявлена высокая контаминация бактериями рода Campylobacter вне зависимости от стадии их обработки (21). Напротив, есть данные о снижении контаминации бактериями рода Salmonella после охлаждения продукции (22).
Полученные нами результаты о влиянии сезона на распространение патогенных микроорганизмов коррелируют с данными зарубежных исследований. Есть сообщения о сезонном влиянии на обнаружение некоторых бактерии, такие как Campylobacter , с пиками, наблюдаемыми летом (23). В нашем случае как раз в летний период и межсезонье была зафиксирована максимальная контаминация патогенными микроорганизмами. Не случайно летний период также связан с мухами-переносчиками, которые могут распространять микроорганизмы внутри и между бройлерными птичниками (24). Кроме этого, есть данные, подтверждающие влияние сезона на интенсивность циркуляции патогенных микроорганизмов в птичниках (25), что также может отражаться и на микрофлоре производственной зоны птицеперерабатывающих предприятий. При низком гигиеническом контроле транспортных средств, а также с учетом перекрестного заражения во время убоя и первичной обработки этот фактор может влиять на санитарный уровень производственных линий и контаминацию оборудования патогенными микроорганизмами.
Результатом оценки устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам оказалась резистентность всех штаммов сальмонелл к налидиксовой кислоте. Есть данные о том, что устойчивость к налидиксовой кислоте может служить маркером повышения устойчивости к фторхино-лонам, как в случае с E. coli (26-28). Это факт находит подтверждение и в полученных нами данных. К классу фторхинолонов относится моксифлокса-цин, к которому у штамма бактерий рода Salmonella S_1 наряду с устойчивостью к налидиксовой кислоте обнаружена резистентность. Считается, что фторхинолоны проявляют классовый эффект в отношении установленных CLSI контрольных точек резистентности, в результате чего снижение чувствительности (то есть повышение минимальной ингибирующей концентрации, МИК) к одному фторхинолону означает одновременное снижение чувствительности ко всем.
Мы оценили чувствительность Salmonella spp. к трем представителям группы фторхинолов (моксифлоксацину, ципрофлоксацину, норфлоксацину). У Salmonella S_1 выявлена устойчивость только к моксифлоксацину, что не совсем типично. Однако для определенных штаммов существуют четкие различия в фармакодинамических свойствах каждого фторхи-нолона и степени, в которой генотипы, ассоциированные с устойчивостью, влияют на МИК каждого фторхинолона.
L. Becnel Boyd с соавт. (29) оценили взаимосвязь между МИК ципрофлоксацина, гатифлоксацина, левофлоксацина и норфлоксацина для клинических изолятов E. coli , устойчивых к фторхинолонам, и отметили значительную вариацию МИК для антибиотиков этой группы. Также была установлена корреляция между МИК ципрофлоксацина и норфлоксацина и значительная взаимосвязь между МИК гатифлоксацина и левофлоксацина, вероятно, являющиеся результатом сходства в структуре препаратов двух пар (29). В нашем исследовании как раз для пары ципрофлокса-цин/норфлоксацин не была отмечена устойчивость.
Еще одной из причин сложившейся ситуации могут быть накопившиеся мутации в генах или плазмидах, обеспечивающих устойчивость на генетическом уровне. Так, изоляты E. coli с более высокой устойчивостью к ципрофлоксацину и левофлоксацину накопили больше генетических изменений (30). Мы можем предположить, что такая разная степень чувствительности к фторхинолонам у Salmonella S_1 связана с факторами, описанными выше. Устойчивость даже только к моксифлоксацину может быть связана с использованием фторхинолонов на крупных птицеводческих предприятиях для профилактики сальмонеллезов (31).
В предыдущих наших публикациях были представлены данные о превалировании резистентности к сульфаметоксазолу. Согласно им, 59,38 % изолятов были резистентны к этому антибиотику (32). В настоящей работе прослеживалась схожая динамика: 3 штамма бактерий рода Salmonella показали резистентность к тетрациклину и сульфаметоксазолу.
Интересные данные были получены при изучении антибиотико-чувствительности листерий. Из 5 штаммов L. monocytogenes только 2 оказались устойчивы к тетрациклину. Актуальные данные указывают на снижение устойчивости к тетрациклину, в отличие от ранних исследований, где тетрациклиновая резистентность встречалась у большинства штаммов L. monocytogenes (33, 34).
Устойчивость бактерий рода Campylobacter к ципрофлоксацину, эритромицину, тетрациклину и налидиксовой кислоте находит подтверждение в литературе (35, 36).
В качестве антимикробной терапии кампилобактериозов чаще выбирают макролиды (такие как эритромицин, азитромицин). Фторхиноло-ны, в частности ципрофлоксацин, также находят широкое применение в лечении диареи неизвестной этиологии (37, 38). Именно к этим антибиотикам была определена резистентность выделенных нами штаммов.
Полученные результаты еще раз показывают, что резистентность патогенных микроорганизмов к антибиотикам различных классов становится глобальной проблемой здоровья населения. Для ее решения необходимо на регулярной основе проводить мониторинг устойчивости к антибиотикам микроорганизмов, циркулирующих в производственной среде предприятий, с целью изучения изменений микробных сообществ и выявления возможных факторов риска для выпуска безопасной продукции.
В нашей работе акцент был сделан на изучении патогенов, которые не контролируются в соответствии с принятыми планами контроля сани- тарного состояния пищевого производства. Однако анализ полученных результатов не был бы полным без их сопоставления с оценкой КМАФАнМ. Следует отметить, что микробиологические исследования реального производства имеют временные, организационные, технологические и прочие ограничения, которые не позволяют собрать большее количество данных. Кроме того, в последние годы все больше экспериментальных данных, особенно в микробиологии, анализируют с помощью методов непараметрической статистики. Во многих случаях непараметрическая статистика остается единственным адекватным способом анализа данных, поскольку зачастую результаты экспериментов дают выборки, к которым статистические методы в принципе неприменимы (14).
В этой связи для оценки статистической достоверности полученных результатов важно понимать, достаточно ли было 72 проб для выявления устойчивых закономерностей по КМАФАнМ. Расчет ошибок первого и второго рода с учетом вычисленной оценки точности показал, что результаты достаточно прозрачны с точки зрения объективной оценки надежности исследования. Исходя из того, что исследование удовлетворяло оценке точности и минимальной суммарной ошибке 0,18 (то есть анализ не превышал 20 % суммарной ошибки), можно в целом доверять нашим выводам. Однако принимая во внимание определенные ограничения при интерпретации результатов непараметрического исследования, при развитии этого направления следует учитывать желательность применения параметрических методов для существенного повышения информативности выводов и улучшения точности результатов.
Учитывая оценку точности полученных результатов, мы считаем, что в целом ожидаемая тенденция снижения КМАФАНМ от грязной зоны (начало производственного процесса) к чистой зоне (окончание производственного процесса) подтвердилась. Однако различие между грязной зоной и промежуточной зоной не имело выраженного характера, что тоже вполне объяснимо распространением контаминации.
Согласно результатам исследования, в летний период, при более высокой температуре окружающей среды, загрязнение объектов производственной среды было ниже на 1-2 порядка. Наибольшее общее количество микроорганизмов было отмечено в межсезонье. Этому могли способствовать еще относительно теплая и влажная осенняя погода по сравнению с более экстремальными условиями летнего и зимнего периода. Повышенное количество микроорганизмов на объектах производственной среды наблюдалось и в зимний период. Хотя достоверность различий в средних значениях КМАФАнМ для летнего и зимнего периода статистически не подтвердилась, в отличие от межсезонья, было отмечено, что вероятность выявления патогенов в межсезонье и летом в 5,25-6,25 раза выше, чем зимой.
В этой связи оптимистичным результатом можно считать тот факт, что на объекте, находящемся на участке упаковки (завершающий этап производственного цикла), в течение всего периода исследований не было патогенных микроорганизмов, хотя значение КМАФАнМ в течение периода наблюдений повышалось на 3 порядка.
Авторы считают, что на гигиеническое состояние поверхности объектов производственной среды в действительности влияет гораздо большее число факторов, которые сложно учесть в одном исследовании. Так, несомненно влияние сменной выработки предприятия, которая может меняться в соответствии с заказами из торговой сети, общим числом персонала, вышедшим в смену, наличием и доступностью средств индивидуальной 750
защиты персонала, расходом воды на мойку и дезинфекцию и другими факторами. Тем не менее полученные нами результаты будут полезны для специалистов, занимающихся вопросами производственной гигиены и разработки производственных программ контроля.
Учитывая, что повышенная контаминация приводит к увеличению риска выявления патогенных микроорганизмов, в том числе к циркуляции мультирезистентных штаммов, важным итогом проведенных исследований можно считать вывод о необходимости изменения подходов к оценке санитарного состояния предприятий, о повышении эффективности санитарной обработки объектов производственной среды и разработки стратегий, обеспечивающих надежный контроль за возможным перекрестным заражением конечной продукции птицеперерабатывающих предприятий. Регулярный отбор смывов на патогенные микроорганизмы непосредственно в процессе производства играет важную роль в поддержании высоких стандартов гигиены и обеспечении безопасности продукции. Такой подход позволяет объективно оценивать текущие условия на различных этапах технологического процесса, что способствует своевременному выявлению потенциальных источников микробиологического загрязнения и принятию соответствующих мер для предотвращения распространения инфекционных агентов. Смывы, проведенные во время производственного процесса, дают возможность идентифицировать ключевые точки контаминации, такие как оборудование, рабочие поверхности и руки персонала, которые могут служить резервуарами для патогенных микроорганизмов. Эти данные служат основой для разработки коррекционных действий, направленных на устранение очагов перекрестного заражения.
Таким образом, мониторинг объектов производственной среды птицеперерабатывающего предприятия в течение года показал, что на их микрофлору оказывают влияние зональность и сезонность. Была установлена вероятность выявления патогенных микроорганизмов (Campylobacter spp., Salmonella spp., Listeria monocytogenes) в производственном процессе, которая составила 42, 17 и 42 % соответственно для грязной, промежуточной и чистой зон. В зависимости от сезонности вероятность выявления патогенов составила 50, 42 и 8 % соответственно для лета, межсезонья и зимы. С применением методов непараметрической статистики получены убедительные доказательства того, что объекты чистой зоны содержали достоверно меньше микроорганизмов по сравнению с объектами грязной и промежуточной производственных зон, хотя промежуточная зона характеризовалась наиболее низкими температурными режимами, исключающими рост многих микроорганизмов. Показано, что межсезонье и летний период представляют наибольшие риски в связи с повышенной контаминацией объектов производственной среды (особенно межсезонье), а также в связи с увеличением вероятности обнаружения патогенных микроорганизмов (лето). Наиболее безопасным периодом работы птицеперерабатывающего предприятия оказалась зима. При проведении исследований на отдельных объектах был зафиксирован наибольший уровень загрязнения — свыше 1х|07 КОЕ/см2, что свидетельствовало о недостаточности проводимых мероприятий по мойке и дезинфекции абиотических объектов производства, не контактирующих с продукцией. Все штаммы патогенных микроорганизмов обладали резистентностью к антибиотикам, 47 % изолятов были определены как мультирезистентные. Эти результаты еще раз подчеркивают проблему бесконтрольного использования и необходимости сокращения антибиотиков в птицеводстве. Несмотря на сравнительно небольшую выборку при микробиологических исследованиях и не- параметрический характер распределения результатов, было продемонстрировано влияние сезонности на распространение микроорганизмов в трех зонах на птицеперерабатывающем предприятии, что свидетельствует о необходимости новых мер и подходов для снижения микробной нагрузки на объектах, не контактирующих с пищевой продукцией. В перспективе такие исследования должны быть расширены. При развитии этого направления следует принимать во внимание желательность применения параметрических методов для существенного повышения информативности выводов и точности результатов, что остается дальнейшей целью авторов.
