Оптимизация методики выявления ДНК Cryptosporidium spp. в образцах кала телят методом ПЦР и сравнение полученных результатов с результатами микроскопии

Кишечные инфекции наносят существенный вред животноводству. Среди паразитарных инфекций наиболее остро эта проблема стоит для криптоспоридиоза. Мониторинг и своевременная диагностика способны существенно снизить заболеваемость криптоспоридиозом среди новорожденных телят. Известно, что молекулярные методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладают высокой чувствительностью, однако при диагностике паразитарных инфекций неэффективная пробоподготовка способна нивелировать это преимущество. В настоящей работе впервые в России мы провели сравнительный анализ различных методов выделения ДНК из фекалий и выбрали оптимальный - с предварительным измельчением образцов мелющими гранулами (bead-beating) и экстракцией ДНК на колонке. Выбранный способ лег в основу разработанной методики диагностики криптоспоридиоза с использованием ПЦР в реальном времени, которая по чувствительности не уступает методам микроскопии. Нашей целью стала разработка метода ПЦР-диагностики криптоспоридиоза, ее апробация на образцах биологического материала от животных и сравнение результатов, полученных этим методом и классическими микроскопическими методами. Образцы фекалий телят голштинской породы были собраны в 2023 году в хозяйствах Вологодской области. Сбор образцов проводили после вспышки криптоспоридиоза в период лечения. Всего было собрано 20 образцов. Образцы фекалий отбирали непосредственно из прямой кишки животного в чистую емкость, каждый образец делили на две пробы, одну из которых использовали для микроскопического исследования по стандартному протоколу, а вторую направляли для ПЦР-исследования, предварительно поместив ее в 70 % раствор этилового спирта для консервации. Для обнаружения криптоспоридий в пробах кала использовали набор для окрашивания по Цилю-Нильсену Диахим (НПФ «Абрис+», Россия). Микроскопию проводили с увеличением ×1000 с масляной иммерсией (световой микроскоп Olympus cx33, «Olympus», Япония). По числу выделенных ооцист в расчете на 1 г фекалий определяли степень инвазированности животных. Для разработки тест-системы на основе ПЦР были выбраны специфические олигонуклеотидные праймеры Crypt-F 5´-TAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGA-3´, Crypt-R 5´-GAGTAAGGAACAACCTCCAATCT-3´, флуоресцентный зонд Crypt-P R6G-5´-ATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGA-3´-BHQ1 в области гена 18S рРНК, позволяющие выявлять все виды Cryptosporidium . Для пробоподготовки образцов кала применяли различные протоколы, включающие использование стандартных концентраторов ГЕМ (ООО «ГЕМ», Россия), концентраторов ГЕМ без формалина или предусматривающие промывку биообразцов фосфатным буфером без концентрирования. После пробоподготовки для экстракции ДНК из осадка кала использовали набор QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit («QIAgen», Германия), включающий стадию очистки ДНК на спин-колонках. Для выделения ДНК из надосадочной фракции осветленного экстракта фекалий, полученной при пробоподготовке по МУ 1.3.2569-09, использовали набор АмплиТест РИБО-преп (ФГБУ ЦСП ФМБА, Россия), позволяющий получить очищенную ДНК методом спиртового осаждения. Мы не выявили преимуществ пробоподготовки с использованием концентраторов ГЕМ, а пробоподготовка в присутствии формалина негативно сказывалась на результатах ПЦР. Получение надосадочной фракции осветленного экстракта с последующей экстракцией ДНК набором АмплиТест РИБО-преп также не позволяло эффективно выделять ДНК Cryptosporidium из-за высоких потерь ооцист в осадочной фракции кала. Эффективными для пробоподготовки биоматериала и экстракции паразитарной ДНК оказались протоколы, предполагающие экстракцию ДНК из цельного кала с механическим дроблением и последующей очисткой ДНК на спин-колонках. Механическое дробление образцов кала твердыми гранулами в пробирках проводили на гомогенизаторе TissueLyser LT («QIAgen», Германия), при этом происходили как гомогенизация материала, облегчающая последующие этапы очистки ДНК, так и разрушение клеток, включая паразитарные, для полного высвобождения нуклеинового материала. По результатам сравнительного эксперимента ооцисты Cryptosporidium spp. были обнаружены методом микроскопии в 15 из 20 проб, причем четыре из 15 положительных образцов имели крайне низкое их содержание, единичные ооцисты. При использовании наилучшего способа пробоподготовки и экстракции ДНК в ПЦР с использованием собственной методики также 15 образцов из 20 были определены как положительные. Для образцов с высоким и умеренным содержанием ооцист криптоспоридий результаты, полученные методом ПЦР, полностью совпали с данными микроскопии. Для двух образцов с низким содержанием ооцист результаты микроскопии и ПЦР расходились: методом ПЦР один образец был определен как слабоположительный (Ct > 40), хотя микроскопия показала отрицательный результат, и наоборот, второй образец, слабоположительный методом микроскопии («+»), был определен как отрицательный методом ПЦР.