Активация антиоксидантной системы у байкальского литорального вида Eulimnogammarus verrucosus

Наличие кислорода в окружающей среде, помимо общеизвестной положительной роли, несет и ряд деструктивных функций. Использование кислорода в процессах дыхания необходимо для существования аэробов. Однако из-за высокой окислительной способности кислорода на клеточном уровне активируется цепь реакций свободнорадикального окисления, сопровождающих процессы кислородного метаболизма [2, 10, 13]. Основным продуктом этих реакций являются активные формы кислорода (АФК) [3, 15, 17], на борьбу с которыми направлена деятельность антиоксидантной системы (АОС) организма [1, 4, 8, 28]. Образование АФК может носить как эндогенный (внутриклеточный), так и экзогенный (внеклеточный) характер. Чувствительность организмов к действию той или иной группы АФК может существенно отличаться [18, 22, 23]. Особенно это актуально для гидробионтов, поскольку вероятность образования, а также длительность существования экзогенных АФК, во многом связаны с температурными и гидрохимическими характеристиками среды [9, 12, 16, 21].

Предположено, что у видов, обитающих в различных условиях, могут наблюдаться и различия в механизмах активации защиты от АФК экзогенного происхождения. С целью проверки данного предположения был проведен ряд исследований на видах, относящихся

Михаил Александрович Тимофеев, научный сотрудник.

к одной таксономической группе, однако отличающихся по своим адаптивным способностям. В качестве исследуемой группы были выбраны пресноводные амфиподы (Amphi-poda, Crustacea).

Ранее нами были опубликованы материалы изучения механизмов активизации АОС при оксидативном стрессе, выполненные на представителях палеарктической фауны амфипод Gammarus lacustris Sars и G. tigrinus [26]. Целью данной работы являлось проведение аналогичного исследования на представителе эндемичной фауны амфипод из оз. Байкал.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали байкальский эндемичный вид Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.). Вид широко распространен по всему Байкалу и встречается повсеместно (под камнями) начиная с глубины в несколько сантиметров, вплоть до глубин в 10-15 м. Обладает высокой чувствительностью к изменениям температуры среды. В проведенных исследованиях гибель 50% и 100% особей данного вида при 25°С наблюдалась через 1,8 и 9 часов соответственно [26]. Термо-преферендум данного вида установлен в температурной зоне 5-6°С; минимальный порог переносимого содержания кислорода, полученный экспериментальным путем, 1 (±0,2) мгО₂ • л^-1 [6, 26].

Рачков отлавливали на урезе воды в районе пос. Большие Коты (Южный Байкал). Перед экспериментами амфипод выдерживали 2-3 дня в аэрируемых аквариумах с бай- кальской водой при температуре 6°-8°С. Окислительное воздействие индуцировали экспонированием амфипод в растворах лабо раторного гуминсодержащего препарата «Schwarzer See» (IGB, Germany), любезно предоставленного

Рис. 1. Активность пероксидазы у E. verrucosus, экспонированного в растворе гуминсодержащего препарата разных концентраций

Рис. 2. Активность каталазы у E. verrucosus, экспонированного в растворе гуминсодержащего препарата разных концентраций

Рис. 3. Активность глутатион S-трансферазы у E. verrucosus, экспонированного в растворе гуминсодержащего препарата разных концентраций

проф. C.E.W. Steinberg (IGB). Известно, что препараты гуминовых веществ в растворах являются продуцентами широкого спектра активных форм кислорода [9, 19, 20, 24].

Была проведена серия экспериментов, в которых рачков экспонировали в растворах препарата с концентрациями 30 и 60 мг/л, приготовленных на байкальской воде. Длительность экспозиции составляла от 30 минут до 6 сут. Для всех экспериментов отбирали здоровых и активных рачков.

Для исследования были выбраны следующие ферменты: пероксидаза, каталаза и глу-татион-З-трансфераза. Приготовление образцов для измерения активности ферментов проводили согласно методике [27]. Замороженных рачков гомогенизировали при 4°С с добавлением натрий-фосфатного буфера 0,1 М рН 6,5 и центрифугировали. В отобранном супернатанте определяли активность ферментов с использованием спектрофотометра UVIKON XS. Активность выражали в нкат/мг белка (катал — единица активности фермента, необходимая для преобразования 1 моля субстрата за 1 сек). Активность пероксидазы измеряли в соответствии с методикой [11], используя в качестве субстрата гваякол при длине волны 436 нм, рН 5; активность каталазы — по методике [7] c добавлением гидроперекиси при длине волны 240 нм, рН 7; активность глутатион-S-трансферазы — в соответствии с методикой [14], используя в качестве субстрата 1-хлор-2,4-динитробензол при длине волны 340 нм, рН 6,5. Содержание белка в пробе определяли по методу Бредфорда при длине волны 595 нм. Все полученные данные обработаны статистически с использованием пакета программ «Statistica 5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 показаны материалы измерения уровней активности пероксидазы у E. verrucosus , экспонированных в растворах гумин-содержащего препарата с концентрациями 30 и 60 мг/л. Из полученных данных видно, что экспозиция амфипод ведет к снижению показателей активности фермента. В растворах с меньшей концентрацией препарата наблюдается достоверное снижение активности пероксидазы начиная с 2 часов экспозиции. В растворах с большей концентрацией ингибирование пероксидазы отмечено уже к 30 мин. экспозиции, при этом показатель активности снижен в 3 раза относительно контроля. Затем к периоду 24-часовой экспозиции уровень активности фермента в растворах обеих концентраций незначительно повышается, приближаясь к контрольному. Далее активность пероксидазы вновь снижается и держится на пониженном уровне вплоть до окончания эксперимента.

На рис. 2 представлены материалы измерения активности каталазы у рачков, экспо нированных в растворах гуминсодержащего препарата с концентрациями 30 и 60 мг/л. Как видно из представленных диаграмм, показатели активности каталазы в ходе экспозиции в основном остаются близкими к контрольному уровню. В экспериментах с растворами большей концентрации отмечали повышение уровня активности каталазы при 2часовом периоде экспонирования.

На рис. 3 показаны материалы измерения активности глутатион-S-трансферазы у E. verrucosus . Из представленных данных видно, что в растворах с меньшей концентрацией отмечали неравномерную активность фермента в ходе всего эксперимента. Однако изменений активности статистически достоверных от контрольного уровня, не отмечено.

Таким образом, как показали проведенные эксперименты, экспозиция E. verrucosus в растворах гуминсодержащего препарата «Schwarzer See» приводит к достоверным изменениям в показателях активности антиоксидантных ферментов каталазы и пероксидазы, тогда как активность глутатион-S-трансферазы остается стабильной. Картина изменения характеристик активности основных антиоксидантных ферментов у байкальского E. verrucosus показывает обратную картину, чем у палеарктических видов С. ishnus , G. tigrinus и G. lacustris . Так, в условиях ранее проведенных аналогичных экспериментов у палеарктических видов отмечали многократный всплеск активности пероксидазы [26]. При этом наблюдали повышение активности глутатион-S-трансферазы и снижение активности каталазы. У байкальского вида происходит ингибирование пероксидазы, активность каталазы повышается, а глу-татион-S-трансферазы остается стабильной. По-видимому, следует говорить о том, что у изученных эндемичных байкальских амфипод наблюдается механизм активации антиоксидантной системы, отличный от такового у палеарктических видов.

Исследование проведено при поддержке грантов РФФИ ( 05-04-97239 Байкал и 06-04-48099-а).