Активность антиоксидантных ферментов полиэкстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica при развитии окислительного стресса в ходе продолжительного культивирования

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 579.222                                        

Активные формы кислорода (АФК), в частности, H 2 O 2 играют неоднозначную роль в биологических системах [1–2] Высокие концентрации H 2 O 2 вызывают окислительный стресс, в то время как при низких концентрациях это соединение является триггером многочисленных сигнальных путей клетки [3]. При низких концентрациях H 2 O 2 также играет решающую роль в индукции т. н. гормезиса – явления, заключающегося в приобретении устойчивости к неблагоприятным воздействиям при мягком воздействии другого стрессового фактора. При этом потенциальный эффект Н 2 О 2 зависит не только от концентрации, но и от физиологического состояния клетки [4].

Продолжительное культивирование дрожжей приводит к накоплению в клетках повреждений, связанных с (1) накоплением мутаций и последующей утратой репродуктивной способности; (2) появлению повреждений дыхательной цепи, вызывающих развитие окислительного стресса по механизму с положительной обратной связью [5]. В этой связи фундаментальный и практический интерес представляет изучение гормезиса, вызываемого различными неблагоприятными воздействиями, как фактора защиты клеток против старения. Исследования, проведенные на модели дрожжей Saccharomyces сerevisiae , показали, что умеренный окислительный стресс, вызванный как варьированием источников углерода, так и предобработкой низкими дозами H 2 O 2 , способствует развитию устойчивости к сильному окислительному стрессу [4, 6], а инициируемые повышением АФК сигнальные события в логарифмической стадии роста дрожжевой культуры приводят к увеличению метаболической активности клеток в поздней стационарной стадии роста [7].

Несмотря на широкое практическое и фундаментальное применение S. сerevisiae в качестве модели окислительно-восстановительных процессов в клетках млекопитающих, этот объект имеет ряд недостатков. Во-первых, S. сerevisiae являются факультативным аэробом, способным к утилизации преимущественно субстратов бродильного типа. Во-вторых, этот вид дрожжей не имеет комплекса I дыхательной цепи митохондрий, а также содержит убихинон вида Q6, который значительно отличается по своей структуре от убихинона «животного типа» Q9-Q10. По этой причине в качестве модели для изучения гормезиса, обусловленного H2O2, мы выбрали лишенные этих недостатков полиэкстремофильные дрожжи Yarrowia lipolytica, которые являются строго аэробным микроорганизмом с полностью компетентной дыхательной цепью митохондрий, и, в отличие от S. cerevisiae, содержат убихинон вида Q9, с девятью единичными изопреноидными боковыми цепями и, таким образом, обнаруживают высокую степень гомологии с убихиноном Q9-Q10 [8], обнаруженным у млекопитающих. Более того, девятнадцать из 23 вспомогательных субъединиц митохондриального комплекса I Y. lipolytica имеют явные ортологи в I комплексе млекопитающих [9].

Предлагаемый модельный организм — полиэкстремофильные дрожжи Y. lipolytica — устойчив к ряду неблагоприятных воздействий и обладает гибкой системой редокс-адаптации, позволяющей эффективно переносить повышение уровней генерации АФК в клетках без заметных изменений параметров роста культуры [10–13]. Несмотря на множество проведенных ранее работ по изучению стрессовых воздействий на клетки дрожжей Y. lipolytica , ключевая сигнальная роль АФК в регуляции метаболизма этого организма остается неясной.

В данной работе изучалось влияние различных концентраций перекиси водорода на окислительно-восстановительный статус в процессе продолжительного культивирования дрожжей Y. lipolytica .

Материал и методы исследования

Объект исследования и условия культивирования . В работе использован штамм Y. lipolytica W29 (дикий тип), полученный из коллекции типовых штаммов CIRM-Levures (Франция). Культивирование штамма проводили как описано в работе [14]. Культуры инкубировали в 750 мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл среды, на шейкере при температуре 28°С и скорости аэрации 180 об./мин. Оптическую плотность (ОП) культуры оценивали спектрофотометрическим методом при длине волны 590 нм. При достижении культурой стационарной стадии роста (18 ч, ОП 590нм = 7,5–8,0) в культуральную жидкость вносили перекись водорода в конечной концентрации 10, 15 и 25 мМ, после чего различные физиолого-биохимические параметры оценивались во временных точках 24, 40 и 120 ч роста культуры, что соответствовало поздней экспоненциальной, ранней и поздней стационарным стадиям роста культуры, соответственно.

Приготовление клеточных гомогенатов. Для изучения активности антиоксидантных ферментов возникла необходимость разработки метода приготовления клеточных экстрактов из очень небольшого (20–80 мг) количества влажной биомассы из-за необходимости производить отбор проб в течение продолжительного культивирования без значительного нарушения параметров аэрации. Для этого из каждой колбы отбирали по 5 мг клеточной суспензии, для поддержания постоянного объема после отбора проб в колбы вносили по 5 мл стерильной дистиллированной воды. Клеточные суспензии центрифугировали в пластиковых пробирках при 6 000 g , после чего осажденную биомассу переносили на фильтр “Milli Q”, промывали дистиллированной водой и отжимали вручную. Полученные таким образом пеллеты взвешивали и помещали в стеклянный притертый гомогенизатор, где растирали на льду в течение 60 с. Полученный гомогенат разводили в соотношении 1:10 в среде следующего состава: MES — 10 мМ, сорбит — 0.5 М, маннит — 0.5 М, ЭДТА — 5 мМ, фенилметилсульфонилфторид, ФМСО — 0,5 мг/мл; pH 6,5. Полученную суспензию переносили в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и осаждали клеточный дебрис при 15 000 g в течение 20 мин при температуре 0–4°С. Клеточные экстракты использовали для исследования активности ферментов первой линии защиты — СОД и каталазы.

Уровень АФК. Для оценки уровня АФК в клетках использовали флуоресцентный краситель эфир дигидро-2',7'-дихлорофлуоресцеина диацетата (ДХФДА). В клеточную суспензию дрожжей, разведенную буфером PBS в соотношении 1:2, добавляли 4 мМ раствор ДХФДА (Sigma, США) в ДМСО до конечной концентрации 40 мкМ и экспонировали в течение 30 мин в темноте, после чего дважды промывали буфером того же состава. В качестве «положительного контроля» использовались клетки дрожжей, обработанные 600 мкМ 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлоридом (АМПА). Измерение флуоресценции полученной суспензии проводили в 96-луночном планшете для измерения флуоресценции при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 528 нм каждые 10 мин на микропланшетном фотофлуориметре Synergy 2 Bio Teck, США) при чувствительности 60% [15].

Измерение активности СОД. Активность СОД оценивали непрямым методом, по ингибированию автоокисления кверцетина [16]. Кверцетин автоокисляется в щелочных условиях (рН 10,0) в присутствии 0,8 мМ тетраметилэтилендиамина (ТМДА) с выделением в качестве побочного продукта реакции супероксид-анион-радикала·и разрушением хромофора с максимумом поглощения при 406 нм. Исследование проводили в 20 мМ К-фосфатном буфере, содержащем 0,1 мМ ЭДТА, и 0,8 мМ ТМДА, рН 7,8 В реакционную смесь вносили 10 мкл гомогената, разведенного 1:50. Реакцию запускали добавлением кверцетина (0,36 мМ). За единицу ферментативной активности СОД принимали 50%-е ингибирование автоокисления кверцетина [16].

Определение каталазной активности. Суммарную каталазную активность определяли по скорости расщепления пероксида водорода. Концентрацию H 2 O 2 измеряли в режиме реального времени фотометрическим методом по поглощению УФ-излучения с длиной волны 240 нм. Активность выражали в милимолях расщепленной H 2 O 2 в мин на 1 мг белка [16].

Статистическая обработка результатов . Каждое измерение было проведено не менее, чем в 4-х физических повторностях и в 3–5 биологических. Достоверными были признаны значения, СКО для которых составило ≤10% от среднего.

Результаты и обсуждение

Как видно на рисунке 1, культивирование клеток Y. lipolytica продолжалось более 450 ч (Рисунок 1, а). Лаг-фаза длилась около 8 часов (Рисунок 1, б), а переход в стационарную стадию роста происходил через 28-30 ч роста. Значительных изменений в течение стационарной стадии роста не отмечалось. Для дальнейших манипуляций и оценки окислительно-восстановительного статуса клеток дрожжей были выбраны следующие точки: 24 ч — поздняя логарифмическая стадия роста; 40 ч — ранняя стационарная и 120 ч — поздняя стационарная стадия. Не наблюдалось и значительных изменений ОП и после внесения различных концентраций перекиси водорода. Таким образом, выбранные нами концентрации перекиси водорода не влияли на параметры накопления биомассы, по крайней мере, на выбранном нами отрезке времени в 120 ч. Кинетика накопления биомассы приведена на Рисунке 1.

Время, часы

—■— Контроль    ▲ 10 мМ    X 15 мМ    ж 25 мМ

Рисунок 1. Кривые роста дрожжей Y. lipolytica W29: а — при продолжительном культивировании; б — после внесения различных концентраций H 2 O 2 в логарифмической стадии роста (показано стрелками).

Изменения уровня АФК в культурах клеток приведены на Рисунке 2.

■ Контроль

■ 10мМ        ■ 15 мМ        ■ 25 мМ

Рисунок 2. Интенсивность флуоресценции (ед.) клеточной суспензии Y. lipolytica W29 через 45 мин после окрашивания ДХФДА.

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 6. №12. 2020

Из Рисунка 2 видно, что в контрольной культуре клеток минимальный уровень АФК отмечался в логарифмической стадии роста, а максимальный — в ранней стационарной стадии роста, что можно связать с метаболической перестройкой культуры для жизни в условиях ограничения по субстрату. К поздней стационарной стадии роста уровень АФК снижался, однако, оставался в 1,5-2 раза выше, чем в логарифмической стадии роста. Введение 10 мМ H 2 O 2 не приводило к значительному изменению уровня АФК через 24 ч и 40 ч культивирования относительно контроля, однако через 120 ч уровень АФК поддерживался на уровне раннего стационара и оставался в этой временной точке более, чем в 2 раза выше, чем в контроле. Введение 15 мМ H 2 O 2 приводило к повышению уровня АФК относительно контроля на 40% в логарифмической стадии роста, при этом в ранней стационарной стадии роста этот параметр находился на уровне контроля, оставаясь достаточно высоким (как и при 10 мМ) в поздней стационарной стадии. Введение 25 мМ H 2 O 2 приводило к резкому росту уровня АФК, который был в 4 раза выше, чем в контроле, уже через 6 часов после внесения. В ранней стационарной стадии роста, однако, этот параметр заметно снижался относительно остальных образцов и составлял ~70% от контроля. К поздней стационарной стадии роста значение этого параметра возвращалось к первоначально высокому значению и заметно не отличалось от других образцов.

Активность СОД в ходе продолжительного культивирования Y. lipolytica представлена на Рисунке 3. СОД является антиоксидантным ферментом первой линии защиты, дисмутирующим супероксид-анион с образованием перекиси водорода.

к - о ю

s

24ч

40ч

120ч

■К

■ 10мМ

■ 15мМ

■ 25мМ

Рисунок 3. Активность СОД в зависимости от времени и внесенной концентрации перекиси водорода.

Профиль изменения СОД в контрольном образце коррелировал с профилем изменения АФК, что может говорить о связи этих двух параметров (Рисунок 4). Введение 10 мМ H2O2 никак не влияло на активность фермента в логарифмической стадии роста, однако уже в ранней стационарной стадии роста измеряемая активность фермента снизилась по сравнению с контролем на ~25%, что может быть связано с эффектом ингибирования фермента конечным продуктом. Сниженная по сравнению с контролем активность СОД наблюдалась в этом случае и в поздней стационарной стадии роста. Введение 15 мМ H2O2 приводило к резкому (более, чем в 2 раза) росту активности СОД в логарифмической стадии роста, однако, уже в ранней стационарной стадии активность фермента достигала значения, характерного для контрольного образца. В поздней стационарной стадии активность СОД снижалась относительно контроля на 20–25%. 25 мМ H2O2 не позволяла активности СОД изменяться ни в ранней, ни в поздней стационарной стадии роста.

■ Контроль

■ 10мМ

■ 15 мМ

■ 25 мМ

Рисунок 4. Интенсивность флуоресценции (ед.) клеточной суспензии Y. lipolytica W29 через 45 мин после окрашивания ДХФДА.

На протяжении всего культивирования активность СОД оставалась на уровне контроля в логарифмической стадии, что можно связать с эффектом ингибирования продуктом. Активность каталазы приведена на Рисунке 5.

■K         ■ 100ul          ■ 150ul          ■ 250ul

Рисунок 5. Активность каталазы в зависимости от времени и внесенной концентрации перекиси водорода.

Активность каталазы в контрольном образце изменялась пропорционально активности СОД и уровню АФК с течением времени. Введение различных концентраций перекиси водорода оказывало значительное влияние на этот параметр. 10 мМ H 2 O 2 приводила к возрастанию активности каталазы по сравнению с контролем на ~20% в логарифмической стадии роста. При этом в ранней стационарной стадии роста этот параметр оставался неизменным, принимая значение на ~20% ниже по сравнению с контролем в этой точке. К поздней стационарной стадии активность этого фермента снижалась до уровня контроля. 15 мМ перекись оказывала более выраженный эффект на активность каталазы в логарифмической стадии роста, который отменялся к началу стационарной стадии — в этом случае значение параметра было вдвое ниже, чем в контроле. Тем не менее, это значение

cc) ® I

сохранялось и в поздней стационарной стадии роста, что превышало уровень контроля на 25–30%. Эффект, оказываемый 25 мМ H 2 O 2 достоверно не отличался от эффекта, оказываемого 10 мМ. Можно предположить, что внесение H 2 O 2 приводило к быстрой индукции каталазы, однако в отличие от СОД, этот эффект длится не долго и снимался уже в ранней стационарной стадии роста.

Сопоставляя данные об уровне АФК в ходе продолжительного культивирования, можно говорить о развитии индуцированного окислительного стресса через 6 часов после внесения H 2 O 2 . Уровень АФК при этом увеличивался дозозависимым образом. Что касается активности антиоксидантных ферментов, то в первую очередь следует отметить ожидаемый всплеск активности каталазы в ответ на внесение H 2 O 2 [17] . Здесь стоит отметить, что активность фермента после внесения 10 мМ H 2 O 2 достоверно отличалась от активности фермента после внесения 15 мМ H 2 O 2. Также следует отметить достоверный рост активности СОД через 6 часов после внесения 15 мМ оксиданта на фоне остальных образцов. Связать такие различия в индукции активностей ферментов в существовании т. н. градиента перекиси водорода [18], который обусловлен внеклеточной концентрацией H 2 O 2 с одной стороны, и скоростью инактивации оксиданта — с другой. Также большое значение имеет проницаемость ЦПМ, которая в ряде случаев является лимитирующим фактором установления перекисного градиента, если клетки имеют конститутивно высокое содержание цитоплазматических каталаз и глутатионпероксидаз, а реакции разложения перекиси имеют кинетику первого порядка. Следует отметить, что все три этих фактора взаимосвязаны между собой, так как внеклеточная перекись водорода способна влиять как на проницаемость мембран [19], так и на активность антиоксидантных ферментов [20]. Таким образом, 15 мМ, предположительно, является именно той концентрацией H 2 O 2 , которая с одной стороны достаточно быстро повышает проницаемость ЦПМ, а с другой — быстро инициирует сигнальные события, приводящие к повышению активности антиоксидантных ферментов.

Наибольший интерес в данном случае представляет эффект резкого роста активности СОД через 6 часов после внесения 15 мМ H2O2. Известно, что митохондриальная Mn-SOD экспрессируется в ответ на повышение уровня АФК [21], причем этот эффект является дозозависимым, а различные концентрации АФК инициируют различные сигнальные механизмы, приводящие в конечном счете к экспрессии генов, кодирующих СОД. Эффект от воздействия 15 мМ H2O2 сохранялся до ранней стационарной стадии, однако, к поздней стационарной стадии роста активность фермента снижалась и оставалась вдвое ниже контроля в этой точке. Ожидаемо, происходило повышение уровня АФК во всех образцах, за исключением обработанного 25мМ H2O2 — в этом случае к началу стационарной стадии роста уровень АФК достоверно снижался. Можно предположить, что заметное повышение уровня АФК через 6 часов после введения оксиданта приводило к быстрой инициации сигнальных событий с последующей активацией защитных механизмов. Таким образом, всплеск генерации АФК, связанный с метаболической перестройкой в начале стационарной стадии роста, клетки переживали, будучи «подготовленными» к этому событию. Сравнительно невысокие активности СОД и каталазы в данном случае говорят о том, что в качестве защитных механизмов выступали не ферменты первой линии защиты, а другие, компоненты, такие как ферменты глутатионовой системы, а также низкомолекулярные антиоксиданты. Стоит отметить, что на протяжении как минимум 12 часов после внесения перекиси водорода клетки продолжали делиться. То есть возникшие изменения могли частично передаваться от материнских клеток дочерним. В данном случае можно предположить, что метаболическая перестройка, связанная с исчерпанием субстрата, приводила к повышению уровня АФК, который затем снижался. Введение 10 и 15 мМ перекиси оказывало слабое влияние на этот параметр в логарифмической и ранней стационарной стадиях культивирования, однако оказывало неожиданный эффект сохранения высокого уровня АФК и в поздней стационарной стадии роста. При введении 25 мМ H2O2 картина несколько изменялась: первые часы культивирования с оксидантом сопровождались резким ростом уровня АФК, после чего он заметно снижался. Этот эффект можно связать с активацией некоторых сигнальных каскадов введением достаточной концентрации перекиси водорода [4, 22], которые «подготавливают» клетку к существованию в условиях ограничения ресурсов. В поздней стационарной стадии роста этот эффект «смягчения» метаболической перестройки отменяется, и уровень АФК снова возрастал.

Влияние умеренного окислительного стресса у молодых культур/организмов на последующее накопление повреждений с течением жизни было продемонстрировано как на модели S. cerevisiae [7], так и на модели свободноживущей нематоды Caenorhabditis elegans , являющейся популярным объектом для исследования процессов старения [23]. В случае Y. lipolytica нам не удалось выявить горметических эффектов 10-25 мМ H 2 O 2 на состояние культуры в поздней стационарной стадии роста. Более того, 15 мМ H 2 O 2 оказывала негативное воздействие на редокс-статус культуры. Это можно связать с развитием окислительного стресса по механизму с положительной обратной связью, в том числе с формированием в ЦПМ кальциевых пор, повышением содержания ионов калия в цитоплазме и повышением в ЦПМ содержания белков семейства НАДФН-оксидаз (NOX), которые, сами по себе могут быть источниками супероксид-радикала при неполном восстановлении H 2 O 2 [24].

Заключение

Исходя из полученных данных можно заключить следующее: введение перекиси водорода в логарифмической стадии роста может иметь отсроченные последствия и приводить к развитию окислительного стресса в поздней стационарной стадии роста, что особенно выражено в случае внесения 15 мМ перекиси. Наблюдаемые эффекты зависят от воздействующего на клетку градиента перекиси водорода в первые часы после введения оксиданта. Этот параметр, в свою очередь, определяется концентрацией H 2 O 2 , проницаемостью ЦПМ и совокупностью антиоксидантных факторов внутри клеток. Различные концентрации H 2 O 2 инициируют различные сигнальные события, часть которых приводит к индукции ферментов первой линии защиты, а часть — к повышению содержания низкомолекулярных компонентов.

Работа выполнена при поддержке госзадания №0112-2019-0001.