Активность ферментов хлоропластов и содержание метаболитов в листьях хлорофилльных мутантов гороха посевного и их гибридов

Сложность исследований по генетике фотосинтеза связана прежде всего с двойным ядерно-цитоплазматическим контролем этого процесса (1). У хлорофилльных мутантов обычно нарушения затрагивают не только систему биосинтеза пигментов, но и активность ряда ферментов, участвующих в ассимиляции углекислого газа, что сопровождается снижением продуктивности растений (2). В то же время выявлен эффект гетерозиса у гибридов гороха от скрещивания хлорофилльного мутанта М-2004 с исходным сортом Торсдаг (3). Повышенную урожайность гибридов можно объяснить увеличением интенсивности фотосинтеза и/или снижением интенсивности дыхания, однако причины этого явления остаются невыясненными. Отчасти поэтому до сих пор не созданы достаточно эффективные селекционные технологии повышения продуктивности растений, основанные на физиолого-биохимической оценке исходного материала.

С целью объяснения эффекта гетерозиса мы определяли активность ферментов хлоропластов и содержание метаболитов в листьях гибридов гороха.

Методика. Объектом исследования служили хлорофилльные мутанты гороха посевного ( Pisum sativum L.) — M-2004 и М-2014 (по каталогу Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова), полученные на основе сорта Торсдаг. Различия между мутантом M-2004 и исходной формой затрагивали один локус; плейотропное действие мутантного гена проявлялось по степени пигментации, высоте растений и зерновой продуктивности (3, 4). У линии М-2014 мутация хлорофилльной недостаточности ( chi ) не локализована. Хлорофилльная недостаточность и низкая продуктивность были характерны для обеих мутантных форм, но у гибридов от скрещивания линии М82

2014 с исходным сортом не выявлено эффекта гетерозиса.

Опыты проводили на экспериментальном участке в 3-4-кратной повторности (по три аналитических повторности в каждой) в течение 3 лет. Определяли урожай зерна с одного растения (анализировали по 15-20 растений каждой формы). В ювенильную фазу онтогенеза (четыре-пять междоузлий) в 9-10 ч утра отбирали одновозрастные, закончившие рост листья верхнего междоузлия. Хлоропласты выделяли методом дифференциального центрифугирования при 4 оС, фракцию несколько раз промывали средой выделения без цистеина и контролировали чистоту препаратов (3). Содержание сахаров определяли микрометодом (по реакции восстановления феррицианида калия) (5), крахмала — сульфосалициловым методом (5), аминокислот — на автоматическом анализаторе «Т-339» (Чехия), малата и пирувата — энзиматическим методом (6), активность ферментов в хлоропластах — на спектрофотометрах «Specord UV-VIS» (Германия) и СФ-46 (Россия) (5). При анализе использовали реактивы фирм «Reanal» (Венгрия), «Serva» (Германия), «Calbiochem» (США) и химически чистые минеральные соли (Россия).

Чистую продуктивность фотосинтеза (ЧПФ) рассчитывали по формуле: ЧПФ = 2(В 2 – В 1 )/[T(S 1 + S 2 )], где S и В — соответственно площадь поверхности и сухая масса листьев в начале и конце учетного периода, Т — продолжительность периода, сут; индекс мобилизации — как отношение массы бобов к массе надземной части растений (7). Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами (8).

Результаты . Удельная активность РБФ-карбоксилазы (рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилаза) — основного фермента ассимиляции углекислого газа — фракции хлоропластов у мутанта М-2004 была почти в 2 раза выше, чем у исходного сорта Торсдаг (табл. 1). Гибридные растения от прямого и обратного скрещиваний мутанта и исходного сорта также характеризовались повышенной активностью фермента по сравнению с сортом Торсдаг, но у гибрида Торсдаг х М-2004 этот показатель был ниже, чем у мутанта М-2004. Относительно высокая активность РБФ-карбоксилазы фракции хлоропластов отмечена у мутанта М-2014. Наиболее высокая активность ГАФ-дегидрогеназы (глицеральдегидрофосфатдегидрогеназа) выявлена у мутанта М-2004, наиболее низкая — М-2014. Различия по показателям активности ФЕП-карбоксилазы (фосфоенолпируваткарбоксилаза), НАДФ-МДГ (никотина-мидадениндинуклеотидфосфат-малатдегидрогеназа) и НАДФ-МЭ (НАДФ-малик-энзим) между мутантами, гибридами и исходным сортом были практически аналогичны таковым по РБФ-карбоксилазе.

1. Удельная активность ферментов фракции хлоропластов листьев хлорофилльных мутантов, гибридов и исходного сорта гороха посевного (мкмоль субстрата/(г - мин сырой массы))

Сорт, линия, гибрид	РБФ-кар-боксилаза	ГАФ-дегид-рогеназа	ФЕП-кар-боксилаза	НАДФ-МДГ	НАДФ-МЭ
Торсдаг	5,5 ± 0,2	24 ± 1,4	0,52 ± 0,01	2,1 ± 0,08	0,6 ± 0,03
М-2004	10,2 ± 0,3	73 ± 2,5	0,75 ± 0,04	9,0 ± 0,11	1,2 ± 0,05
Торсдаг х М-2004	6,1 ± 0,2	42 ± 4,0	0,59 ± 0,02	3,2 ± 0,06	0,7 ± 0,02
М-2004 х Торсдаг	9,7 ± 0,4	38 ± 4,5	0,73 ± 0,04	8,6 ± 0,17	1,1 ± 0,03
М-2014 Коэффициент линейной корреляции ( r )	8,9 ± 0,4	10 ± 1,8	1,06 ± 0,07	4,4 ± 0,12	1,0 ± 0,03
между активностью фермента и урожаем –0,47       0,004        –0,73 зерна с одного растения П р и м е ч а н и е. Полные названия ферментов см. в разделе «Результаты».				–0,17	–0,46

Выявлено отсутствие прямой положительной корреляционной связи между активностью ферментов фракции хлоропластов и урожаем зерна с одного растения. При этом чем выше была активность РБФ-карбокси-лазы, НАДФ-МЭ и особенно ФЕП-карбоксилазы в хлоропластах, тем ниже зерновая продуктивность растений.

При сравнении активности ферментов фракций хлоропластов у гибридов выявлено доминирование по материнской линии. По активности ГАФ-дегидрогеназы гибриды занимали промежуточное положение по отношению к обеим родительским формам. Увеличение активности ГАФ-дегидрогеназы в листьях гибридов, по-видимому, обусловливает повышение содержания в хлоропластах триозофосфатов, причем более значительное, чем у растений сорта Торсдаг, но меньшее, чем у мутанта М-2004, что согласуется с полученными ранее данными (3). Известно, что триозофосфаты играют ведущую роль как в процессах биосинтеза углеводов, так и обмене восстановительных эквивалентов через оболочку хлоропластов (9). При этом обеспечивается более высокая интенсивность транспорта, транспирации и газообмена в листьях растений (10). Активность ГАФ-дегидрогеназы фракции хлоропластов у мутанта М-2014 была значительно ниже, чем у остальных форм, что можно объяснить нарушениями структуры и/или процесса биосинтеза этого фермента, а также повышенной активностью ФЕП-карбоксилазы. Происходящие при этом изменения метаболизма приводят к снижению содержания крахмала и повышению содержания серина, аспартата и малата в листьях растений (табл. 2).

2. Содержание метаболитов в гомогенате листьев хлорофилльных мутантов, гибридов и исходного сорта гороха посевного

Метаболит

Торсдаг

М-2004

Торсдаг х М-2004

М-2004 х Торсдаг

М-2014

	У г л е в о д ы,		мг/г сырой массы
Крахмал	15,3 ± 0,4	7,7 ± 0,2	12,9 ± 0,8	10,1 ± 0,2	6,8 ± 0,2
Сахароза	9,8 ± 0,3	6,1 ± 0,3	7,8 ± 0,2	6,2 ± 0,3	5,4 ± 0,1
Редуцирующие сахара	10,3 ± 0,3	9,7 ± 0,2	6,3 ± 0,2	7,1 ± 0,2	9,1 ± 0,3
	А м и	н о к и с л о т ы,	мкмоль/г сырой массы
Аланин	42,7 ± 1,6	10,0 + 0,5	26,4 ± 0,9	10,1 ± 1,0	12,6 ± 1,0
Глицин	1,3 ± 0,1	2,0 ± 0,1	1,6 ± 0,1	1,2 ± 0,1	0,8 ± 0,1
Серин	26,8 ± 1,1	9,6 ± 0,4	25,7 ± 0,9	18,6 ± 0,9	54,2 ± 2,1
Аспартат	19,9 ± 0,6	25,8 ± 0,8	15,9 ± 0,3	10,8 ± 0,4	39,1 ± 1,4
	О р г а н	и ч е с к и е к и с л о т ы*, мкмоль/мг белка
Малат	27,9 ± 1,2	29,1 ± 1,0	16,1 ± 0,5	18,3 ± 0,6	50,3 ± 1,2
Пируват	17,3 ± 0,2	58,9 ± 2,0	56,4 ± 1,2	63,8 ± 1,9	14,4 ± 0,5

* Приведены данные для фракции хлоропластов.

Между содержанием крахмала и сахарозы в листьях выявлена прямая корреляционная зависимость, что свидетельствует о более быстром метаболизме этих соединений как у обоих мутантов, так и у гибридов по сравнению с исходным сортом. Аналогичные данные получены у гибридов кукурузы (11).

Коэффициенты линейной корреляции между содержанием крахмала, сахарозы, аланина, пирувата в листьях растений и урожаем зерна имели положительные значения (соответственно 0,72; 0,50; 0,37; 0,47); между содержанием редуцирующих сахаров, серина, аспартата, малата и урожаем — отрицательные (соответственно –0,67; –0,40; –0,93; –0,89); между содержанием глицина и урожаем прямая корреляция отсутствовала ( r = = 0,11). Эти данные позволяют косвенно судить о направленности метаболизма и изменении активности ряда ключевых ферментов восстановительного и окислительного путей метаболизма углерода. Коэффициент линейной корреляции между активностью РБФ-карбоксилазы в хлоропластах и содержанием углеводов в листьях составлял r = –0,88 (как по отношению к крахмалу, так и к сахарозе).

Коэффициенты линейной корреляции между активностью ГАФ-дегидрогеназы и содержанием крахмала и сахарозы составляли соответственно r = –0,15 и r = –0,14, что свидетельствует о значительном участии ГАФ-дегидрогеназы скорее в транспорте веществ через мембрану хлоропластов, чем в накоплении крахмала и сахарозы (9). Можно предположить, что именно снижение активности ГАФ-дегидрогеназы в хлоропластах приводило к резкому уменьшению продуктивности мутанта М-2014 и отсутствию эффекта гете- розиса у гибридов от скрещивания этой линии и исходного сорта Торсдаг (табл. 3). При этом у мутанта М-2014 было нарушено соответствие между показателем ЧПФ и урожаем зерна. В целом следует отметить, что коэффициенты линейной корреляции между показателями фотосинтетической и зерновой продуктивности у исследуемых форм имели высокие значения (0,91-0,98).

Коэффициент линейной корреляции ( r = 0,64) отражал соотношение активности карбоксилирующих ферментов в хлоропластах (при явно различающейся удельной активности), то есть активность хлоропластной ФЕП-карбоксилазы существенно зависела от таковой РБФ-карбоксилазы (см. табл. 1). По-видимому, это может быть связано с использованием в реакциях карбоксилирования одного и того же субстрата (бикарбонат/углекислый газ). Повышение активности ферментов цикла Кальвина (РБФ-карбоксилаза и ГАФ-дегидрогеназа) в хлоропластах мутантных и гибридных форм сопровождалось увеличением активности ферментов метаболизма С 4 -дикарбоновых кислот (ФЕП-карбоксилаза, НАДФ-МДГ и НАДФ-МЭ), что также наблюдалось при исследовании других ферментов (12).

3. Оценка фотосинтетической продуктивности хлорофилльных мутантов, гиб ридов и исходного сорта гороха посевного

Сорт, линия, гибрид Чистая продуктивность фотосинтеза, мг/(дм2 • сут) Индекс мобилизации Высота растений, см Урожай зерна с одного растения, % Торсдаг 63±3 0,68±0,02 170±5 100 М-2004 26±1 0,55±0,02 96±3 20-30 Торсдаг х М-2004 78±3 0,80±0,03 208±6 140-150 М-2004х Торсдаг 75±3 0,76±0,03 207±5 130-150 М-2014 45±2 0,29±0,01 110±4 2-3 Коэффициент линейной корреляции (r) между фотосинтетической продуктивно- 0,91 0,94 0,98 – стью и урожаем зерна с одного растения

Снижение содержания аланина, аспартата и малата в листьях гибридных форм по сравнению с исходным сортом Торсдаг свидетельствует о более интенсивном метаболизме этих веществ, одним из продуктов превращения которых является пируват (см. табл. 2). При этом более интенсивные процессы утилизации аланина и накопления пирувата обусловлены влиянием (доминированием) генотипа мутанта М-2004. У низкопродуктивного мутанта М-2014 не наблюдалось явной зависимости между содержанием в листьях аланина, аспартата, малата и пирувата. Трудно объяснить повышенное содержание малата по отношению к пирувату во фракции хлоропластов этого мутанта при наличии высокоактивного НАДФ-МЭ и низком соотношении НАДФН/НАДФ (13). По-видимому, у мутанта М-2014 не соблюдался необходимый баланс синтезируемых in vivo АТФ и НАДФН, что было обусловлено недостаточным синтезом АТФ при низком содержании хлорофилла и невозможностью интенсивной утилизации НАДФН ГАФ-дегидрогеназой (3, 9). При этом даже при повышенной активности оксалоацетат-декарбоксилазы и высокой (по сравнению с сортом Торсдаг) активности НАДФ-МДГ не обеспечивалось образование такого количества пирувата в хлоропластах, как у исходного сорта.

Сопоставление активности НАДФ-МДГ и НАДФ-МЭ, с одной стороны, и содержания малата и пирувата в той же фракции хлоропластов, с другой, свидетельствует об очень слабой прямой зависимости (или ее отсутствии) между НАДФ-МЭ и малатом, НАДФ-МЭ и пируватом, НАД-МДГ и малатом — соответственно r = 0,21; r = 0,45; r = –0,13, что подтверждает различный характер регуляции метаболизма С 4 -дикарбоновых кислот в хлоропластах (12).

Значительное накопление серина в листьях мутанта М-2014 отражает частичное подавление интенсивности дыхания, по-видимому, на одном из этапов превращения этого субстрата в фосфоглицерат (см. табл. 2). Об этом свидетельствует также пониженное содержание глицина, из которого образуется серин. Наоборот, в листьях мутанта М-2004 метаболизм серина проходил более интенсивно при, видимо, меньшей скорости его образования из глицина. Выделяющийся при дыхании аммиак обычно включается в реакцию с глутаминовой кислотой (9). Накопление глутамина могло тормозить реакцию дезаминирования аспартата и его превращение в оксалоацетат и служить одной из причин накопления аспартата у мутанта М-2014.

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о ведущей роли ГАФ-дегидрогеназы в проявлении эффекта гетерозиса у гибридов гороха посевного от скрещивания хлорофилльного мутанта М-2004 и исходного сорта Торсдаг, а также более активном процессе утилизации синтезируемых в результате фотосинтеза углеводов ферментами дыхания.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    T a y l o r W.С. Regulatory interactions between nuclear and plastid genomes. Annu. Rev. Plant Physiol. and Mol. Biol., 1989, 40, 1: 211-233.

• 2.    Изогенные линии и генетические коллекции. Мат. II совещ. Новосибирск, 1993.

• 3.    V a i s h l y a О.В., L a d y g i n V.G., S o k o l o v V.A. е.а. Characterization of photosynthetic apparatus of pea chlorophyll mutants and their heterotic F 1 hybrids with standard genotype (cv.

• 4.    С о к о л о в В.А. Изучение механизма гетерозиса. Автореф. докт. дис. Новосибирск, 1992.

• 5.    Методы биохимического исследования растений. Л., 1972.

• 6.    P l u m b - D h i n d s a P.L., D h i n d s a R.S., T h o r p e T.A. Non-autotrophic CО 2 fixation during shoot formation in tobacco callus. J. Exp. Bot., 1979, 30, 117: 759-767.

• 7.    Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения. М., 1989.

• 8.   П л о х и н с к и й Н.А. Биометрия. М., 1970.

• 9.  Э д в а р д с Дж., У о к е р Д. Фотосинтез С-3 и С-4 растений: механизмы и регуляция. М.,

  • 10.    С о к о л о в В., Ш у м н ы й В., Ц о н е в Ц. и др. Частота, размер и функциональные характеристики устьиц в связи с гетерозисом у гороха. Изв. СО АН СССР, сер. биол., 1988, 2: 89-94.

  • 11.    D w a y e r L.M., A n d r e w s С.J. Carbohydrate levels in field-grown leafy and normal maize genotypes. Crop Sci., 1995, 35, 10: 1020-1027.

  • 12.    И в а н и щ е в В.В., Г о р е н к о в а Л.Г. Исследование ферментов биосинтеза фосфое-нолпирувата и утилизации оксалоацетата у изогенных мутантов гороха. Физиол. раст., 1995, 42, 5: 754-758.

  • 13.    T a k a h a m a U., S h i m i z u - T a k a h a m a М., H e b e r U. The redox state of the NADP system in illuminated chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1988, 916, 3: 446-452.

Torsdag). Photosynthetica, 1998, 35, 3: 428-443.

Томский государственный университет,