Активность In vitro противогрибковых препаратов в отношении дрожжевых грибов - возбудителей оппортунистических микозов

К возбудителям вторичных микозов относят условно-патогенные (оппортунистические) виды грибов – распространенные во внешней среде, которые также могут сохраняться и в тканях человека. Развитию инфекционного процесса, вызванного условно-патогенным грибом, обычно предшествует первичная болезнь или снижение иммунного статуса [1, 4]. В последние годы расширился состав вероятных возбудителей оппортунистических микозов, часть из которых первично устойчивы к широко применяющимся в лечении противогрибковым препаратам [5, 6, 10]; разработаны новые препараты с различным спектром действия [1–4]. Вызывающая иммунодефицит ВИЧ-инфекция и СПИД предрасполагают к развитию у пациентов данной группы ряда тяжелых оппортунистических микозов: криптококкоза центральной нервной системы (ЦНС), кандидоза полости рта и глотки, системного и диссеминированного кандидоза и других, менее распространенных грибковых заболеваний [1, 2, 5]. Природную чувствительность возбудителя микоза во многом определяет его родовая и видовая принадлежность [5, 6, 10].

Цель данного исследования – анализ уровней чувствительности к противогрибковым препаратам штаммов дрожжевых грибов, выделенных при диагностике микозов различной локализации у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ (2013–2014 гг.).

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили:

• –    четыре штамма Cryptococcus neoformans – возбудителя

криптококкоза ЦНС [диагностический материал – спинномозговая жидкость];

• –    два штамма Candida glabrata – возбудителя кандиде-мии (диагностический материал – кровь);

  – 33 штамма грибов рода Candida [ C. albicans (11 штаммов), C. glabrata (9), C. krusei (4), C. rugosa (1), C. tropicalis (8)] и штамм Saccharomyces cerevisiae , выделенные при диагностике грибковых инфекций органов дыхания (диагностические материалы – жидкость бронхоальвеолярного лаважа, мокрота и мазок из зева).

Определение чувствительности клинических штаммов дрожжевых грибов к противогрибковым препаратам проводили методом микроразведений в бульоне со средой RPMI 1640 с определением минимальных подавляющих концентраций (МПК) в мкг/мл с помощью системы «Sensit-itre» (колориметрический тест «YeastOne»), TREK Diagnostics Systems. Система «Sensititre» соответствует международному стандарту тестирования чувствительности дрожжевых грибов Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [7] и включает современные противогрибковые препараты группы азолов (флуконазол, итраконазол, вориконазол, позаконазол, кетоконазол), группы эхинокандинов (анидулафунгин, каспофунгин, микафунгин), амфотерицин В и флуцитозин (5-фторцитозин). Для клинической интерпретации результатов определения чувствительности грибов Candida spp. к антимикотикам были использованы пограничные значения МПК, установленные CLSI для стандартного метода M27-A3 [7–9].

Результаты и обсуждение

Полученные данные определения чувствительности клинических штаммов родов Candida , Cryptococcus

и Saccharomyces к противогрибковым препаратам представлены в таблицах 1–3.

Высокая фунгицидная активность в отношении штаммов грибов рода Candida была характерна для всех трех препаратов группы эхинокандинов – аниду-лафунгина, каспофунгина и микафунгина (табл. 1). Все штаммы четырех видов Candida с установленными пограничными значениями МПК препаратов ( C. albicans , C. glabrata , C. krusei , C. tropicalis ) были определены как чувствительные к анидулафунгину, каспофунгину и микафунгину.

В сравнении с эхинокандинами, активность азольных препаратов против штаммов Candida spp. была, в целом, ниже (табл. 2, 3).

Наибольшей активностью в отношении клинических штаммов рода Candida обладал вориконазол (относительно высокое значение МПК вориконазола равное 4 мкг/мл было выявлено только у одного штамма C. glabrata , выделенного из крови).

Отметим, что устойчивые к флуконазолу штаммы были выделены не только среди видов с пониженной и вариативной чувствительностью к данному препарату ( C. glabrata , C. krusei , C. tropicalis ), но и у двух из 11 про-

Табл. 1. Активность препаратов группы эхинокандинов, амфотерицина В и флу-цитозина в отношении клинических штаммов грибов родов Candida , Cryptococcus и Saccharomyces (тест-система «Sensititre» YeastOne)

Вид	Препарат, диапазон МПК
	AND	CAS	MF	AB	5FC
C. albicans	0,03–0,12	0,03–0,06	≤ 0,008–0,03	0,12–0,5	≤ 0,03–0,12
C. glabrata	≤ 0,015–0,03	0,06–0,12	≤ 0,008–0,015	0,25–0,5	≤ 0,03
C. krusei	0,03	0,06–0,25	0,12	0,12–0,5	2–8
C. rugosa	0,06	0,06	0,03	0,5	0,06
C. tropicalis	0,03–0,12	0,015–0,12	0,015–0,03	0,25–0,5	≤ 0,03–>64
Cr. neoformans	>8	16	>8	0,25–1	2–8
S. cerevisiae	0,12	0,25	0,06	0,5	0,06

Примечание: AND – анидулафунгин, CAS – каспофунгин, MF – микафунгин, AB – амфотерицин В, 5-FC – флуцитозин; МПК – минимальная подавляющая концентрация (в мкг/мл).

тестированных штаммов C. albicans (18%). Согласно современным подходам к интерпретации лабораторных данных, все обнаруженные штаммы гриба C. krusei обозначаются как устойчивые к препарату флуконазол без интерпретации значения МПК (вид C. krusei обладает природной устойчивостью к флуконазолу) [9].

Устойчивые к итраконазолу штаммы были обнаружены только у вида C. glabrata – возбудителя, с характерно низкой природной чувствительностью к препаратам группы азолов. Обращает на себя внимание высокий уровень дозозависимых к итраконазолу штаммов C. glabrata , C. krusei и C. tropicalis (табл. 3).

Установленные крайне высокие значения МПК ани-дулафунгина (>8 мкг/мл), каспофунгина (16 мкг/мл) и микафунгина (>8 мкг/мл) против штаммов Cr. neoformans подтверждают имеющиеся в литературе сведения об исходной устойчивости гриба к эхинокандинам [1, 2, 10]. Природную устойчивость главного возбудителя криптококкоза к эхинокандинам определяет наличие у Cr. neoformans мукополисахаридной капсулы и низкое содержание 1,3-β-D-глюкана в клеточной стенке [1, 2]. Отметим, что инкапсулированный гриб Cryptococcus neoformans способен вызывать тяжелые и диссемини- рованные формы криптококкоза у больных с клеточным иммунодефицитом, причем на фоне СПИД наиболее распространенной формой криптококкоза является криптококкоз центральной нервной системы [1, 2, 5].

Клинические пограничные значения МПК триазольных препаратов для вида Cr. neoformans и S. cerevisiae не определены. Отметим низкие значения МПК вориконазола (от 0,015 до 0,06 мкг/мл) и итраконазола (от 0,03 до 0,06 мкг/мл) против штаммов Cryptococcus neoformans , не предполагающие наличие устойчивости in vitro к данным препаратам, а также относительно высокую активность флуконазола с МПК 2, 4, 4 и 16 мкг/мл. Вместе с тем, одно из четырех установленных значений МПК флуконазола равное 16 мкг/мл следует расценивать как

Табл. 2. Активность препаратов группы азолов в отношении клинических штаммов грибов родов Candida , Cryptococcus и Saccharomyces (тест-система «Sensititre» YeastOne)

Вид	Препарат, диапазон МПК
	FZ	IZ	VOR	PZ	KZ
C. albicans	0,25–128	0,03–0,25	≤ 0,008–0,25	≤ 0,008–0,12	≤ 0,008–0,03
C. glabrata	8–128	0,5–>16	0,25–4	1–>8	0,5-4
C. krusei	32–64	0,12–0,25	0,06–0,25	0,12–0,25	0,12–0,25
C. rugosa	8	0,12	0,06	1	0,06
C. tropicalis	1–32	0,03–0,5	0,015–0,5	0,015–1	≤ 0,008–0,5
Cr. neoformans	2–16	0,03–0,06	0,015–0,06	0,03–0,25	0,015–0,06
S. cerevisiae	8	0,25	0,06	0,5	0,015

Примечание : FZ – флуконазол, IZ – итраконазол, VOR – вориконазол, PZ – позакона-зол, KZ – кетоконазол; МПК – минимальная подавляющая концентрация (в мкг/мл).

относительно высокое.

Среди протестированных клинических штаммов родов Candida , Cryptococcus и Saccharomyces не было выявлено ни одного штамма, вероятно устойчивого к препарату амфотерицин B. Активность флуцитозина была также высока – обнаружен единственный штамм C. tropicalis , устойчивый к флу-цитозину с МПК >64 мкг/мл.

Клинические пограничные значения МПК антимикотиков для вида S. cerevisiae не определены, однако высоких значений МПК, предполагающих наличие устойчивости in vitro у протестированного штамма выявлено не было.

Табл. 3. Интерпретация показателей минимальных подавляющих концентраций флуконазола, итраконазола и вориконазола в отношении клинических штаммов грибов рода Candida (тест-система «Sensititre» YeastOne) *

Вид n	Препарат, пограничные значения МПК, интерпретация n, (%)
	FZ			IZ			VOR
	S	SDD	R	S	SDD	R	S	SDD	R
C. albicans 11	≤ 2	4	≥ 8	≤ 0,125	0.25-0.5	≥ 1	≤ 0.125	0.25-0.5	≥ 1
	9 (81,8)	0 (0,0)	2 (18,2)	9 (81,8)	2 (18,2)	0 (0,0)	10 (90,9)	1 (9,1)	0 (0,0)
C. glabrata 11	–	≤ 32	≥ 64	≤ 0,125	0.25-0.5	≥ 1	–	–	–
	–	9 (81,8)	2 (18,2)	0 (0,0)	7 (63,6)	4 (36,4)	–	–	–
C. krusei 4	1 –	1 –	1 –	≤ 0,125	0.25-0.5	≥ 1	≤ 0.5	1	≥ 2
	–	–	4 (100)	1 (25,0)	3 (75,0)	0 (0,0)	4 (100)	0 (0,0)	0 (0,0)
C. rugosa 1	–	–	–	≤ 0,125	0.25-0.5	≥ 1	–	–	–
	–	–	–	1 (100)	0 (0,0)	0 (0,0)	–	–	–
C. tropicalis 8	≤ 2	4	≥ 8	≤ 0,125	0.25-0.5	≥ 1	≤ 0.125	0.25-0.5	≥ 1
	4 (50,0)	2 (25,0)	2 (25,0)	3 (37,5)	5 (62,5)	0 (0,0)	5 (62,5)	3 (37,5)	0 (0,0)

Заключение

Проведенное исследование выявило высокий уровень фунгицидной активности анидулафунгина, каспофунгина и микафунгина в отношении штаммов различных болезнетворных видов грибов рода Candida , что предполагает использование эхинокандинов для эмпирической терапии системных и диссеминированных форм кандидоза, в том числе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

С учетом вариабельной активности флуконазола и итраконазола в отношении клинических штаммов Candida spp., в алгоритм лабораторной диагностики глубокого кандидоза следует включать определение лекарственной чувствительности штаммов Candida spp. стандартизованным методом, позволяющим проводить клиническую интерпретацию получаемых результатов in vitro .

Возбудитель криптококкоза гриб Cr. neoformans обладает природной устойчивостью к препаратам группы эхинокандинов, что подтвердили полученные результаты исследования чувствительности четырех штаммов-возбудителей криптококкоза ЦНС. Системные противогрибковые препараты вориконазол и амфотерицин В возможно использовать для терапии криптококкоза без определения лекарственной чувствительности возбудителя к антимикотикам, а в случае применения флуконазола целесообразно определять у возбудителя чувствительность in vitro .