Активность карбоксипептидазы Е при длительном действии ноотропных препаратов

Введение. Ноотропы являются нейрометаболическими стимуляторами и представляют собой лекарственные средства, предназначенные для оказания специфического воздействия на высшие функции мозга (Лапина, Золотарева, 2009; Золотарева, 2011). В комплексе их биологических функций особый интерес представляет нейропротективное влияние - повышение устойчивости нервных клеток к воздействию неблагоприятных факторов различного рода.

Протеолитические ферменты, участвующие как в образовании, так и в деградации нейропептидов, контролируют уровень опиоидных пептидов и стресс-пептидов (Fricker, 1991; Scholzen, 2007). В процессинге предшественников опиоидных пептидов и стресс-пептидов участвует карбоксипептидаза Е (КПЕ) (Вернигора, 2010).

В связи с этим представляется практически значимым исследование влияния нейрометаболических стимуляторов на активность КПЕ.

Цель работы - изучить активность КПЕ в тканях крыс при длительном действии ноотропных препаратов (пирацетам, фенотропил, ноопепт).

Методика. Работа выполнена на 48 самцах белых беспородных крыс возрастом 3 мес. и массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50%) с естественным световым режимом на сбалансированной диете при свободном доступе к воде, удовлетворяющей требованиям «Руководства по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях» (Каркищенко и др., 2010).

Для изучения длительного влияния ноотропных лекарственных средств на активность КПЕ пирацетам вводили внутрибрющинно в дозе 300 мг/кг (Назарова и др., 2007), фенотропил в дозе 100 мг/кг (Белоусов, Мухина, 2005), ноопепт в дозе 10 мг/кг (Коваленко и др., 2002) каждые 24 ч в течение 14 сут. Контрольные животные получали эквивалентный объем физраствора. Крыс выводили из эксперимента через 24 и 72 ч после последней инъекции путем декапитации. Схема проведенного эксперимента показана на рис. 1.

Рис. 1. Схема проведенного эксперимента

После декапитации извлекали гипофиз, четверохолмие, продолговатый мозг, гипоталамус, гиппокамп, амигдалу, стриатум и надпочечники. Ткани погружали в физиологический раствор, охлажденный до 3°С, после чего тщательно очищали их от оболочек и кровеносных сосудов. Активность КПЕ определяли методом Supattapone et al. (1984), белок - методом Лоури (1951). Активность КПЕ выражали в нмоль образовавшегося продукта реакции за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью следующих пакетов программ: Microsoft Office Exel 2010 (Microsoft, США), Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., США) и BioStat 2009 Professional. Достоверность различий между группами определяли с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (при р<0,05) для сравнения средних независимых выборок с учетом предварительной проверки выборок на нормальность распределения. Результаты представлены в виде М ± т, где М - среднее, т -стандартная ошибка среднего. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным р=0,05 (Р=95%).

Результаты и обсуждение. Активность КПЕ в нервной ткани крыс при длительном действии пирацетама представлена на рис. 2. Активность КПЕ через 24 ч после последней инъекции пирацетама была выше на 56% по сравнению с контрольной группой животных.

Через 72 ч после последней инъекции активность КПЕ была выше на 46% по сравнению с контрольной группой самцов. В четверохолмии активность фермента повышалась на 72% через 24 ч и снижалась на 72% через 72 ч по сравнению с контрольной группой животных. В продолговатом мозге активность КПЕ снижалась на 21% и 75% через 24 и 72 ч после последней инъекции препарата соответственно. В гипоталамусе активность КПЕ была снижена на 20% через 24 ч и повышена на 25% через 24 и 72 ч соответственно. В гиппокампе активность исследуемого фермента повышалась через 24 ч, а через 72 ч в амигдале и стриатуме снижалась на 37% и 36% соответственно. В надпочечниках обнаружено повышение активности КПЕ на 160% через 24 ч по сравнению с контрольной группой животных.

Активность КПЕ в нервной ткани крыс при длительном действии ноопепта показана на рис. 3.

Через 24 ч после последнего введения ноопепта активность КПЕ в гипофизе оказалась сниженной на 38% по сравнению с контрольной группой животных. В четверохолмии длительное введение ноопепта вызывало повышение активности КПЕ на 66% и снижение на 10% через 24 и 72 ч после последней инъекции ноопепта по сравнению с контрольной группой животных. Продолговатый мозг ответил повышением активности КПЕ на 13% и 17% через 24 и 72 ч соответственно после последней дозы ноопепта по сравнению с контрольной группой самцов.

Гипофиз

Четверохолмие

Продолговатый мозг

Гипоталамус

Гиппокамп

Стриатум

Рис. 2. Активность КПЕ при действии пирацетама в нервной ткани крыс

(нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ±т, п=6; * - р<0,05, ** - р<0,01, *** р<0,001 относительно контроля).

Четверохолмие

Продолговатый мозг

Гипоталамус

Гиппокамп

Стриатум

Амигдала

Надпочечники

72 ч

Рис. 3 . Активность КПЕ при действии ноопепта в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ±т, п=6; * - р<0,05, ** - р<0,01, *** р<0,001 относительно контроля).

Рис. 4. Активность КПЕ при действии фенотропила в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ±ш, п=6; * - р<0,05, ** - р<0,01, *** р<0,001 относительно контроля).

- 12 -

В гипоталамусе обнаружено повышение активности КПЕ на 19% через 24 ч после последнего введения ноопепта по сравнению с контролем. Активность КПЕ в гиппокампе возрастала на 49% и 14% через 24 и 72 ч соответственно после последней инъекции ноопепта по сравнению с контрольной группой животных. Через 24 ч после последнего введения ноопепта амигдала и надпочечники обнаружили повышение уровеня активности КПЕ по сравнению с контрольной группой животных на 24% и 60% соответственно.

Активность КПЕ в нервной ткани крыс при длительном действии фенотропила отражает рис. 4.

Длительное введение фенотропила вызывало повышение активности КПЕ на 24% через 24 ч и снижение на 9% через 72 ч после последней инъекции по сравнению с контрольной группой животных. В четверохолмии обнаружено повышение активности КПЕ на 36% через 24 ч и снижение на 112% через 72 чпо сравнению с контролем.

Так же выявлено снижение активности КПЕ через 72 ч после последней инъекции препарата в продолговатом мозге на 27% и надпочечниках на 119% по сравнению с контролем. Активность КПЕ в амигдале снижалась по сравнению с контрольной группой животных на 44% и 14% через 24 и 72 ч соответственно.

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о наличии общих тенденций изменений активности КПЕ в условиях длительного режима введения применяемых нейрометаболических стимуляторов: наименее выраженная активность изученного фермента отмечалась в надпочечниках, наиболее высокая активность наблюдалась в гипофизе. В порядке уменьшения влияния на активность КПЕ в гипофизе на этапе выведения из эксперимента крыс путем декапитации через 24 ч после последней инъекции ноотропные препараты можно расположить в следующем ряду: пирацетам, фенотропил, ноопепт.

Выводы. 1. Среди изученных отделов нервной ткани крыс наименьшая активность КПЕ выявлена в надпочечниках. 2. Изменение активности КПЕ в гипофизе в опытной группе крыс, по сравнению с контрольной, на этапе их выведения из эксперимента через 24 ч после последней инъекции путем декапитации наблюдалось в сторону увеличения при введении пирацетама и фенотропила, и в сторону уменьшения - при введении ноопепта. 3. Наиболее выраженное влияние на активность КПЕ оказал пирацетам.