Активность карбоксипептидазы Е в нервной ткани крыс после однократного введения ноотропных препаратов

Введение. Рост числа нейродегенеративный и церебровакулярных заболеваний населения развитых стран обуславливает актуальность изучения фармакотерапии нарушений когнитивной деятельности. Терапевтическая коррекция подобных патологий включает в себя применение препаратов различных групп, одной из которых являются ноотропные лекарственные средства.

Ноотропы - большая группа препаратов, оказывающая нейропротекторное действие, обладающая низкой токсичностью, способных облегчать процессы запоминания и обучения, переключение между разными видами деятельности, улучшающие концентрацию внимания, анализ ситуации и принятия решений, усиливающих мотивацию (Воронина, 2000; Давыдова, 2001).

Изучение потенциальных механизмов действия ноотропов ведется с момента синтеза пирацетама - первого препарата с ноотропным действием в 1963 г. Однако, несмотря на почти 40-летнюю историю исследования, окончательные механизмы действия ноотропов к настоящему времени до конца не выявлены. Среди них рассматриваются «мемранная гипотеза», вовлечение холинергической, ГАМКергической, пептидергической медиаторных систем (Семина и др., 2001; Winblad,

2005; Cooke, Bliss, 2006; Malykh, Sadaie, 2010). Имеются данные об участии ряда нейропептидов в организации когнитивных процессов (Коротков, 2003; Андреянова и др., 2007). Механизм реализации эффектов нейропептидов опирается на концепцию регуляторного континуума, характеризующегося наличием межпептидных взаимодействий, при которых эффект действия определенного пептида вызывает каскад изменений уровней других нейропептидов, так же обладающих модулирующим действием (Ашмарин, Каразеева, 1996). В процессинге нейропептидов непосредственное участие принимает карбоксипептидаза Е, поэтому исследование ее активности позволяет глубже раскрыть механизмы реализации ноотропных эффектов при действии ноотропных препаратов.

Цель работы - исследовать активность карбоксипептидазы Е в нервной ткани крыс после однократного действия пирацетама, фенотропила и ноопепта.

Методика. Эксперимент выполнен на 96 самцах белых беспородных крыс возрастом 3 месяца и массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50 %) с естественным световым режимом на сбалансированной диете при свободном доступе к воде, удовлетворяющей требованиям «Руководства по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях» (Каркищенко, Грачев, 2010). Исследование выполнено в соответствии с Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), и требованиями «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н.

Для изучения однократного влияния ноотропных лекарственных средств на активность КПЕ пирацетам вводили внутрибрющинно в дозе 300 мг/кг (Назарова и др., 2007), фенотропил в дозе 100 мг/кг (Белоусов, Мухина, 2005), ноопепт в дозе 10 мг/кг (Коваленко и др., 2002). Контрольные животные получали эквивалентный объем физраствора. Крыс выводили из эксперимента через 0,5, 4, 24 и 72 ч после инъекции путем декапитации. После декапитации извлекали гипофиз, четверохолмие, продолговатый мозг, гипоталамус, гиппокамп, амигдалу, стриатум и надпочечники. Ткани погружали в физиологический раствор, охлажденный до 3°С, после чего тщательно очищали их от оболочек и кровеносных сосудов. Активность карбоксипептидазы Е определяли методом Supattapone et.al. (1984), белок определяли методом Лоури (Lowry, 1951). Активность КПЕ выражали в нмоль образовавшегося продукта реакции за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью следующих пакетов программ: Microsoft Office Exel 2010 (Microsoft, США), Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., США) и BioStat 2009 Professional. Достоверность различий между группами определяли с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (при р<0,05) для сравнения средних независимых выборок, с учетом предварительной проверки выборок на нормальность распределения. Результаты представлены в виде М ± щ, где М - среднее, m - стандартная ошибка среднего. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным р=0,05 (Р=95%).

Результаты и обсуждение. Влияние однократного действия пирацетама показано на рис. 1. Установлено, что активность КПЕ в гипофизе повышалась в 1,3 раза через 0,5 ч после введения пирацетама по сравнению с контрольной группой животных. Через 4 ч активность снизилась в 2,4 раза по сравнению с контролем. По прошествии 24 ч после введения препарата активность исследуемого фермента в гипофизе повысилась в 1,2 раза, а через 72 ч снизилась в 1,49 раза по сравнению с контрольной группой самцов. В четверохолмии активность карбоксипептидазы Е снижалась в 1,4, 2,5 и 1,3 раза по сравнению с контрольной группой через 0,5, 24 и 72 ч соответственно. Через 4 ч после введения пирацетама достоверных отличий активности КПЕ в четверохолмии по сравнению с контролем не наблюдалось.

В продолговатом мозге наблюдалось снижение активности КПЕ в 1,9, 1,2 и 2,5 раза по сравнению с контрольной группой животных через 0,5, 4 и 24 ч соответственно. По истечении 72 ч активность исследуемого фермента в продолговатом мозге была выше в 1,11 раз по сравнению с контрольной группой животных. Активность карбоксипептидазы Е в гипоталамусе снижалась в 2,2 и 1,5 раза по сравнению с контрольной группой самцов через 0,5 и 24 ч соответственно. В гиппокампе активность исследуемого фермента снижалась в 2,2, 1,9 и 1,1 раза через 0,5, 24 и 72 ч соответственно по сравнению с контрольной группой животных.

Активность КПЕ в амигдале была снижена в 2,4, 1,4 раза через 0,5 и 4 ч, а по истечении 24 ч возрастала в 1,6 раза по сравнению с контрольной группой. В стриатуме активность КПЕ была снижена в 3,9, 1,4, 1,7 и 1,7 раза по равнению с контролем через 0,5, 4, 24 и 72 ч соответственно. В надпочечниках активность исследуемого фермента оказалась сниженной в 3,3, 2,1, 1,3 и 1,5 раза через 0,5, 4, 24 и 72 ч соответственно по сравнению с контрольной группой животных.

Рис. 1 . Активность КПЕ при действии пирацетама в нервной ткани крыс

(нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мт белка, М ±т, п=6; * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 относительно контроля)

После однократного введение фенотропила (рис. 2) по сравнению с контрольной группой животных в гипофизе обнаружено повышение активности карбоксипептидазы Е в 1,6 раза через 0,5 ч и снижение в 2,5, 1,2 раза через 4 и 24 ч соответственно. В четверохолмии по сравнению с контролем выявлено снижение активности КПЕ через 0,5, 4, 24 и 72 ч в 2,1, 1,1, 1,2 и 1,3 раза соответственно. Продолговатый мозг на однократное введение фенотропила ответил снижением активности КПЕ в 1,9, 1,3 раза через 0,5, 24 ч соответственно и повышением активности исследуемого фермента через 72 ч в 1,1 раза по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе выявлено снижение активности КПЕ в 2,5 и 1,5 раза через 0,5 и 24 ч, а так же повышение активности карбоксипептидазы Е через 4 часа в 1,8 раза по сравнению с контролем. В гиппокампе обнаружено снижение активности КПЕ после однократного действия фенотропила через 0,5 и 24 ч в 4,9 и 1,8 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных.

Активность карбоксипептидазы Е в амигдале после однократного действия фенотропила снижалась в 3,5, 1,9 раза через 0,5 и 24 ч и повышалась в 1,2 раза через 24 ч по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме активность КПЕ по сравнению с контролем была снижена в 2,7, 1,4 и 1,4 раза через 0,5, 4, и 72 ч соответственно. После однократного действия фенотропила активность карбоксипептидазы Е в надпочечниках снижалась в 2,6 раза через 0,5 ч и повышалась в 1,3 раза через 24 ч по сравнению с контрольной группой животных.

Активность карбоксипептидазы Е после однократного действия ноопепта (рис. 3) повышалась в 1,3 раза через 0,5 ч, снижалась через 4 ч в 3,3 раза по отношению к контрольной группе животных. В четверохолмии активность КПЕ была повышена в 3,7 и 1,6 раза через 0,5 и 4 ч соответственно по отношению к контрольной группе самцов. В продолговатом мозге активность КПЕ снижалась в 1,4 и 1,3 раза через 0,5 и 25 ч соответственно после введения ноопепта по сравнению с контрольной группой. Гипоталамус на введение препарата ответил снижением активности карбоксипептидазы Е в 2,1 и 1,4 раза через 0,5 и 24 ч соответственно по сравнению с контрольной группой животных. В гиппокампе активность рассматриваемого фермента оказалась сниженной по сравнению с контрольной группой животных в 1,4 раза через 0,5 и 24 ч.

Гипофиз

Четверохолмие

Продолговатый мозг

Гипоталамус

Гиппокамп

Амигдала

Стриатум

Надпочечники

Рис. 2. Активность КПЕ при действии фенотропила в нервной ткани крыс

(нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М±т, п=6;

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 относительно контроля)

Рис. 3 . Активность КПЕ при действии ноопепта в нервной ткани крыс (нмоль

продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ±ш, п=б; * -р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 относительно контроля)

Активность КПЕ в амигдале после однократного введения ноопепта снижалась в 1,4, 1,1 и 1,3 раза через 0,5, 24 и 72 ч соответственно и была повешена в 1,4 раза через 4 ч по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме однократное введение препарата вызывало снижение активности КПЕ в 2,1, 1,3, 1,9, 1,6 раза через 0,5, 4, 24 и 72 ч соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Надпочечники на однократное введение ноопепта ответили снижением активности КПЕ в 1,1, 1,4 раза через 0,5, 4 ч соответственно и повышением активности карбоксипептидазы Е в 1,4 раза через 24 ч по сравнению с контрольной группой животных.

Таким образом, в проведенных исследованиях показано, что активность изученного фермента у крыс на фоне введения изучаемых ноотропных препаратов может служить одним из маркерных тестов для выявления возможного нейрохимического механизма их действия.

Выводы. 1. Максимальная активность карбоксипептидазы Е в нервной ткани крыс после однократного действия исследуемых ноотропных препаратов наблюдалась в гипофизе через 0,5 ч после инъекции: при введении пирацетама и ноопепта повышалась в 1,3 раза, по сравнению с контрольной группой животных; фенотропила — в 1,6 раза (р < 0,05).

• 2.    Активность карбоксипептидазы Е в надпочечниках крыс после однократного действия исследуемых ноотропных препаратов, по сравнению с контрольной группой животных, наиболее снижалась в надпочечниках через 0,5 ча после инъекции: при введении пирацетама - в 3,3 раза, фенотропила - в 2,6 раза, ноопепта -1,1 раза (р < 0,05).

• 3.    Сравнительный анализ изменений активности карбоксипептидазы Е в условиях краткосрочного режима введения применяемых ноотропных препаратов (пирацетама, фенотропила, ноопепта) позволил выявить и общие тенденции: в гипофизе максимальная активность наблюдалась через 0,5 ч после инъекции, в продолговатом мозге и надпочечниках - через 24 ч после инъекции.