Активность пероксидазы в различных органах растений хрена и других сельскохозяйственных культур

Пероксидаза относится к хромопротеидам, содержащим в качестве активного центра железопорфириновый комплекс (гемоглобины, миоглобины, цитохромы, каталазы). Хромопротеиды играют существенную роль в функционировании ферментных систем митохондрий, микросом, пластид, транспорте кислорода и различных веществ, а также в защитных реакциях (особенно у растений от инфекционных и токсических агентов).

Широко известно применение пероксидазы в качестве метки антител в им-муноферментных тест-системах для диагностики практически всех известных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы. Однако в настоящее время наибольшее количество публикаций посвящено использованию пероксидазы в конструировании биосенсоров, которые представляют собой в большинстве случаев ферментные электроды с амперометрической детекцией сигнала и используются для аналитического определения перекиси водорода, аминофенолов, кокаина, цианидов, глюкозы, а также этанола в крови и моче. Теоретически при наличии моноклональных антител, специфичных к химическим соединениям, относящимся к биологически опасным веществам, возможна разработка биосенсоров для экспресс-идентификации последних в объектах окружающей среды (1-3). В промышленности пероксидазу применяют для дезактивации фенола и хлорфенолов в сточных водах (4). Разработан и практически апробирован метод десульфатизации топлива, основанный на биока-талитическом окислении пероксидазой органических сульфидов и тиофенов с переводом их в сульфоксиды и сульфоны с последующей редистилляцией топлива. При этом содержание серы в топливе снижается в 5 раз (5). Дистиллированные экстракты из корня хрена применяют также для временного консервирования мясных полуфабрикатов (6).

В научно-исследовательских работах пероксидазу используют в качестве зонда при оценке функций и структуры центральной и периферической нервной системы, метки олигонуклеотидных зондов для выявления ДНК и РНК в патологическом материале, катализатора при синтезе полианилинов на матрице сульфатированного полистирола или полимеров на основе фенолов и нафтолов.

Расширение областей применения пероксидазы обусловливает необходимость совершенствования технологии ее получения, начиная с этапа выращивания растений — источников фермента. В связи с этим целью нашей работы была оценка влияния условий выращивания растений хрена на содержание пероксидазы в различных органах, а также сравнение активности пероксидазы, выделенной из хрена и других видов растений.

Методика. Материалом для исследования служили растения хрена ( Armora-cia rusticana ) сорта Толпуховский с плантаций совхоза «Ставровский» (Владимирская обл.), где он возделывается в монокультуре с 1990 года. С целью определения ценности сырья для выделения фермента изучали активность пероксидазы в различных органах растений хрена. Использовали одно-, двух- и многолетние растения, выращенные в идентичных агрохимических условиях на одних и тех же участках одного и того же поля и собранные в июле. Пробы корней (сердцевина, покровные ткани), стеблей и листьев анализировали в течение суток после сбора растений. После предварительного измельчения размеры частиц в любом измерении не превыша-100

ли 5 мм. Гомогенат взвешивали и суспендировали в 0,05 М растворе двузамещенного фосфата калия (рН 8,4) при соотношении 1:2. Затем частицы измельчали на ножевом гомогенизаторе до размеров не более 1-2 мм. Полученную суспензию инкубировали при температуре 2- 10 ^оС в течение 2 ч и осветляли центрифугированием в течение 15 мин при 2500 g .

Активность пероксидазы в надосадочной жидкости определяли пирогал-лольным методом. В стеклянных пробирках готовили смесь следующего состава: 0,32 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 6,0); 0,16 мл 0,147 М раствора перекиси водорода; 0,32 мл 5 % раствора пирогаллола; 2,10 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирки переносили в спектрофотометрическую кювету толщиной 1 см и при λ = 420 нм устанавливали показание оптической плотности на нулевое значение. Затем в кювету добавляли 0,1 мл исследуемого раствора, перемешивали и измеряли увеличение поглощения за 20 с.

Активность пероксидазы рассчитывали по формуле Eg = = 7,5 ⋅∆ A ₄₂₀ ⋅ F , где ∆ А ₄₂₀ — изменение оптической плотности реакционной смеси за 20 с; F — разведение препарата, использованное для определения активности пероксидазы; 7,5 — расчетный коэффициент.

При определении активности пероксидазы в единицах титра поверхность лунок микропланшет блокировали 0,1 % раствором Твин-80, содержащим 1 % казеина, приготовленном на забуференном фосфатами (ЗФР) 0,15 М растворе NaCl (рН 7,4). После удаления блокирующего раствора препараты пероксидазы на ЗФР титровали в лунках микропланшетов и добавляли субстратный буферный раствор на основе ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethilbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt).

Динамику содержания пероксидазы в корнях хрена определяли в порослевой культуре. Растения брали с полей, которые различались по условиям культивирования и составу почвы (табл.).

Агрохимическая характеристика состава почвы при выращивании хрена сорта Толпуховский на различных полях

Название поля	Площадь, га	Агрохимический состав почвы
		рН	п К 2 О, мг%   1	Р 2 О 5 , мг%     1	Гумус, %
Суровый-1	7,0	6,3	17,9	> 25,0	3,15
Суровый-2	7,0	6,3	17,9	> 25,0	3,15
Энергетик	3,6	5,7	> 25,0	> 25,0	3,75
Раздолье	3,0	4,6	21,0	22,7	2,95
Ягодка	10,0	6,3	23,8	> 25,0	4,40

Для сравнительной оценки пероксидазной активности использовали растения следующих видов: редис красный ( Raphanus sativus L. var. radicula ), редька сорта Зимняя черная ( Raphanus sativus L. var. niger ), репа сорта Петровская ( Brassica cam-pestris L. var. esculanta ), мокрица ( Stellaria media ).

Результаты . Наибольшее содержание пероксидазы в пересчете на 1 г сырой ткани выявлено в сердцевине корня, наименьшее — в листьях растений хрена (рис. 1). У двух- и многолетних растений содержание пе-

жания пероксидазы в различных частях растений хрена, различающихся продолжительностью жизненного цикла: 1, 2 и 3 — соответственно одно-, двух- и многолетние растения; I и II — соответственно листья и стебли, III и IV — соответственно корковая часть и сердцевина корней.

роксидазы в тканях стеблей и корня было выше, чем у однолетних. В практическом аспекте интересно отметить, что корковая часть корня, удаляемая в отход при изготовлении пищевого хрена, содержит почти такое же количество пероксидазы, как и его центральная часть, то есть может служить сырьем для выделения пероксидазы. В стеблях и листьях пероксидаза также содержится в количествах, позволяющих считать эти органы растений хрена перспективным сырьем для промышленного получения фермента.

При исследовании динамики содержания пероксидазы в корнях хрена в летнеосенний период было отмечено убывание активности фермента в период с июля по октябрь (рис. 2). Вместе с тем в зависимости от условий возделывания этот процесс может начинаться раньше или позже примерно на 1 мес. В корнях растений, выращиваемых на полях, различаю- щихся по агрохимическому составу почвы, в парных пробах, отобранных в пределах 1-1,5 мес, регистрировали как повышение, так и понижение активности пероксидазы. Возможно, это связано с влагообеспеченностью в этот период.

В листьях по динамике активности пероксидазы не удалось выявить зависимости от условий выращивания. Однако на некоторых полях наблюдалась тенденция к повышению активности пероксидазы в листьях при снижении таковой в корнях.

Содержание пероксидазы в различных органах растений хрена при разных условиях выращивания существенно и достоверно различалось по периодам вегетации. Однако эти различия в ходе культивирования нивелировались, а затем приобретали обратный характер. Это свидетельствует о том, что выявленные различия характеризуют не абсолютную разницу по содержанию пероксидазы, а влияние на созре-

Рис. 2. Динамика содержания пероксидазы в кор- нях растений хрена, выращиваемых на полях,

вание растений хрена условий выращивания. Следовательно, при выборе оптимального срока заготовки тех или иных органов растений хрена для их использования в качестве источников пероксидазы необходимо проводить мониторинг содержания фермента и учитывать данные за предыдущие годы.

Традиционно как для изучения ферментативных свойств пероксидазы, так и для практического использования в различных отраслях науки и техники применяют пероксидазу из корней хре- на. В то же время известно, что перок- сидаза синтезируется у раз-

поч-  Рис. 3. Сравнительная оценка содержания

, 4 и 5 пероксидазы в корнях различных сельскохо-вый-1,  зяйственных растений в зависимости от их бл.). возраста: I — Stellaria media; II — редис сорта Красный гигант; III и IV — редька сорта Зимняя черная; V и VI — репа сорта Петровская; VII, VIII, IX и X — хрен сорта Толпуховский соответственно двух-, одно-, двух- и однолетний корень. Дата проведения анализа: I, II, III, V, VII и VIII — 19 октября; IV, VI, IX и Х — 23 сентября.

личных видов растений, поэтому мы проанализировали активность фермента в листьях, стеблях и корнеплодах хрена, редиса, редьки, репы и мокрицы (рис. 3).

Показатели по содержанию пероксидазы в стеблях и листьях у всех растений имели близкие значения. Вместе с тем в корнях двух- и многолетних растений хрена активность была выше, чем у растений других видов, за исключением редьки, у которой этот показатель был практически таким же, как у однолетних форм хрена. Вполне возможно, что при оценке различных сортов редьки удастся выявить образцы, содержание пероксидазы в корнеплодах которых будет соответствовать таковому в корнях многолетних форм хрена. В этом случае редьку можно рассматривать в качестве перспективной сырьевой базы для получения пероксидазы, так как урожайность ее растений выше, чем у хрена, а стадии подготовки ткани корнеплода для экстракции более технологичны (от сбора урожая до очистки).

Таким образом, в период с июля по октябрь отмечена тенденция к уменьшению активности пероксидазы в корнях растений хрена. У двух- и многолетних растений хрена содержание пероксидазы в корнях выше, чем у однолетних, причем в корковой части, удаляемой в отход при изготовлении пищевого хрена, содержится практически такое же количество пероксидазы, как и в сердцевине. Показано, что содержание пероксидазы в корнеплодах редьки и у однолетних растений хрена не различается.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    Y a n g R., R u a n C., D e n g J. A H 2 O 2 biosensor based on immobilization of horseradish-peroxidase in electropolymerized methylene green film on gce. J. of Applied Electrochemistry, 1998, 28, 11: 1269-1275.

• 2.    B r y n d a E., H o m o l a J., H o u s k a M. e.a. Antibody networks for surface-plasmon resonance immunosensors. Sensors and Actuators b-Chemical, 1999, 54, 1-2: 132-136.

• 3.    M u l c h a n d a n i A., P a n S. Ferrocene-conjugated M-phenylenediamine conducting polymer-incorporated peroxidase biosensors. Analytical Biochemistry, 1999, 267, 1: 141-147.

• 4.    Z h a n g T., Z h a o Q.X., H u a n g H. e.a. Kinetic-study on the removal of toxic phenol and chlorophenol from waste-water by horseradish-peroxidase. Chemosphere, 1998, 37, 8: 1571-1577.

• 5.    A y a l a M., T i n o c o R., H e r n a n d e z V. e.a. Biocatalytic oxidation of fuel as an alternative to biodesulfurization. Fuel Processing Technology, 1998, 57, 2: 101-111.

• 6.    W a r d S., D e l a q u i s P., H o l l e y R. e.a. Inhibition of spoilage and pathogenic bacteria on agar and precooked roast beef by volatile horseradish distillates. Food Research International, 1998, 31, 1: 19-26.

Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии                 Поступила в редакцию и микробиологии, 601120, Владимирская обл., г. Покров                    2 февраля 2000 года

PEROXIDASE ACTIVITIES IN DIFFERENT ORGANS OF HORSERADISH PLANTS AND OTHER AGRICULTURAL CROPS

Yu.M. Emelin, N.A. Vlasov, B.V. Novikov, A.D. Sereda, D.S. Volokhov, L.G. Fugina, S.V. Sereda

S u m m a r y

The authors studied the influence of growing conditions of horseradish plants on peroxidase content in different organs. It was shown, that peroxidase content in horseradish roots is reduced at the period from July to October. It was established, that peroxidase content in radish storage roots is the same, practically, one-year plants of horseradish have in roots.