Активность щелочной и кислой фосфатаз в тканях тощей кишки у разновозрастных кроликов

Как известно, особенностью физиологии кроликов является то, что в начальные периоды онтогенеза они обладают высокой скоростью роста и в течение первых месяцев жизни масса их тела способна увеличиваться более чем в 10 раз. Связывают это, в частности, с высокими питательными свойствами молозива и молока, которыми питаются крольчата. На физиологическом уровне усвояемость данных продуктов обеспечивается достаточно сформированными и приспособленными к данному процессу органами пищеварения. Так как рост организма в целом осуществляется благодаря координированному росту и развитию всех органов и систем, несомненно, в течение первых месяцев жизни пищеварительная система также претерпевает значительные изменения, которые, в частности, обусловлены нарастающими потребностями животного в питательных веществах и постепенным изменением характера поступающей пищи. В связи с этим, целю исследования было выявление изменений активности щелочной (ЩФ) и кислой фосфатаз (КФ) в тканях слизистого и мышечного слоев тощей кишки тонкого кишечника у крольчат, в разные возрастные сроки, постнатального онтогенеза [11, 12, 13].

Щелочная и кислая фосфатазы являются хорошо изученными и наиболее распространёнными среди фосфатаз группами ферментов. Они характеризуются широкой субстратной специфичностью, которая может несколько отличаться у ферментов, выделенных из разных тканей и органов. Наибольшую активность кислая фосфатаза проявляет при рН 4,7-6, оптимальным для щелочной фосфатазы является – 8,4-9,4. Щелочная и кислая фосфатазы имеются во многих тканях организма, но их уровень может существенно отличаться. Так, например, высокая активность щелочной фосфатазы наблюдается в развивающихся тканях, секреторных органах, в тканях, осуществляющих транспорт питательных веществ, а также в хрящевой ткани.

В научной литературе приводятся данные, свидетельствующие о неравномерном становлении ферментных систем в тканях различных органов животных, кроме этого выявлено, что имеются отличия и в пределах одного органа в его различных частях, отделах, долях [1, 2, 3, 5, 6, 7]. Работы же по изучению активности внутриклеточных ферментов в различных отделах и слоях кишечника растущих животных немногочисленны [4, 9, 10]. А между тем, единая и сложная функция пищеварения происходит благодаря сочетанию многих процессов (секреция, всасывание, перистальтика и др.), которые осуществляются разными клетками и тканями органа и могут отличаться и иметь свои особенности, на протяжении всего кишечника.

Материал и методы исследований. Для изучения изменений активности исследуемых ферментов в переходных фазах питания использовали крольчат породы серый великан в возрасте 1, 6, 12, 18, 24, 30, 45, 60, 90 и 120 суток по 5 голов в каждом возрасте, выращенных в условиях личного хозяйства с соблюдением необходимых ветеринарно-санитарных правил и норм кормления в весенне-летний сезон. Физиологические параметры крольчат соответствовали параметрам соответствующего возраста.

Эвтаназию крольчат и все манипуляции выполняли с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [8]. Кишки тонкого кишечника извлекали из брюшной полости, очищали от содержимого, промывали холодным физиологическим раствором, разделяли на части и пробы их тканей замораживали в жидком азоте для дальнейших исследований.

В научной лаборатории ФГБОУ ВО Чувашская ГСХА в гомогенатах тканей тощей кишки спектрофотометририческим методом (UV-1800) и с использованием набора реагентов компании ОАО «Витал Девелопмен Корпорэйшн» СПб определяли активности щелочной и кислой фосфатаз в соответствии методикам. Расчет активности ферментов провели по калибровочным.

Степень достоверности различий средних величин определяли с помощью критерий Стьюдента. Для достоверности суждений разделяли уровни значимости р≤0,05, р≤0,01 и р≤0,001.

Результаты исследований. Резуль- таты по изучению активности щелочной и кислой фосфатаз в тканях тощей кишки у кроликов приведены в таблицах 1 и 2.

Уровень щелочной фосфатазы (ЩФ) (мкмоль/г*ч) в тканях слизистого слоя тощей кишки у новорожденных крольчат, питающихся только молозивом, относительно высокий и примерно равный на всем протяжении: в проксимальном отделе – 331,8±19,3, медиальном – 350,7±18,7, дистальном – 344,6±26,2. В мышечном слое кишки он неравномерный, возрастает в дистальном направлении: в проксимальном отделе – 167,7±15,3, медиальном – 224,7±21,5, дистальном – 349,1±22,9. К шестисуточному сроку активность данного фермента в мышечном слое увеличивается в проксимальном отделе на 55,9 %, р≤0,001 до 261,4±25,9, медиальном – 58 %, р≤0,01 до 354±18,7. В это время наблюдается значительное снижение уровня фермента в слизистом слое проксимального отдела на 58,7 %, р≤0,001 до 137,0±12,6, но к двенадцатисуточному возрасту он вновь повышается, в 2,3 раза, р≤0,001 до 303,0±26,8. К данному сроку изменения отмечаются и в мышечном слое: происходит снижение активности ЩФ в медиальном и дистальном отделах, соответственно на 23,6 %, р≤0,01 до 271,2±15,3 и 32,1 %, р≤0,01 до 233,9±18,5.

Таблица 1 – Активность щелочной фосфатазы в тканях тощей кишки

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 – по отношению к предыдущему возрасту

У восемнадцатисуточных крольчат существенные изменения в тканях слизистого слоя не выявляются, но происходят колебания уровня фермента в мышечном. В проксимальном отделе наблюдается его снижение на 23 %, р≤0,05 до 247,0±21,1, в дистальном – он возрастает на 35,1 %, р≤0,05, до 316,0±29,8. В возрасте двадцать четыре дня отмечено снижение активности ЩФ на протяжении всей кишки в мышечном слое (проксимальном – в 3,4 раза, р≤0,001 до 72,8±6,9; медиальном – в 2,7 раза, р≤0,001 до 105,9±10,1; дистальном – в 2 раза, р≤0,01, до 157,9±13,6) и в слизистом слое в проксимальном отделе (на 29,3 %, р≤0,05, до 224,7±21,7). У месячных крольчат понижение уровня фермента продолжается во всех отделах тощей кишки в слизистом слое (проксимальном – на 20,2 %, р≤0,05 до 179,3±14,2; медиальной – 30,2 %, р≤0,05 до 209,4±18,3; дистальном – на 29,6 %, р≤0,05, до 212,2±19,6) и в проксимальном отделе мышечного слоя (в 2,1 раза, р≤0,01 до 35,1±2,5). В мышечном слое дистального отдела, наоборот, обнаруживается увеличение на 29,3 %, р≤0,05 до 204,1±14,5. У сорокапятисуточных животных активность ЩФ по сравнению с тридцатисуточными меняется в мышечном слое: уменьшается в медиальном отделе до 67,2±6,1, на 41 %, р≤0,01, дистальном – до 137,0±15, на 32,9 %, р≤0,05, повышается в проксимальном отделе до 50,7±4,9, на 44,5 %, р≤0,05. Также увеличение отмечается в слизистом слое медиального отдела тощей кишки до 282,3±25,7, на 34,8 %, р≤0,05. Изменения в активности данного фермента в тканях наблюдаются и в последующие месяцы жизни кроликов. Так у двухмесячных животных она возрастает в слизистом слое проксимального и дистального отделов, соответственно в 1,8 раза, р≤0,01 до 330,4±25,9 и 1,4 раза, р≤0,05 до 284,0±19,0, в мышечном слое в проксимальном и медиальном отделах, соответственно в 4,2 раза, р≤0,001 до 212,7±20,0 и в 2,5 раза, р≤0,001, до 168,8±15,2. У трехмесячных вновь отмечается снижение уровня в слизистом слое в проксимальном отделе на 19,6 %, р≤0,05 до 265,6±15,2, медиальном – 19,4 %, р≤0,05 до 245,6±11,1, дистальном – 51,7 %, р≤0,001 до 137,0±13,9, в мышечном слое – в проксимальном отделе на 39,2 %, р≤0,01 до 129,3±11,0, дистальном – на 75,2 %, р≤0,001 до 40,5±3,9. Через месяц активность ЩФ в тканях отличается повышением в слизистом слое в медиальном и дистальном отделах, соответственно до 317,4± 25,9, на 29,2 %, р≤0,01 и до 279,5±19,5 в 2 раза, р≤0,001, в мышечном слое – в проксимальном отделе до 200,8±19,0, на 55,3 %, р≤0,01, медиальном – 196,3±17,0, на 33,2 %, р≤0,05, дистальном – 237,2±22,0, в 5,9 раза, р≤0,001.

Таблица 2 – Активность кислой фосфатазы в тканях тощей кишки

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 – по отношению к предыдущему возрасту

Активность кислой фосфатазы (КФ) (мкмоль/г*ч) в тканях тощей кишки у кроликов значительно ниже, чем ЩФ. У су- точных животных она сравнительно невысокая. Наименьшая активность КФ определяется в проксимальном отделе, как в слизистом, так и в мышечном слое (соответственно, 13,6±1,3 и 13,6±0,9); большая – в медиальном (соответственно, 33,9±2,6 и 25,7±2,1) и средняя в дистальном (соответственно, 24,0±2,1 и 16,0±1,3). У шестисуточных крольчат уровень фермента значительно увеличивается: в слизистом слое проксимального отдела в 5 раз, р≤0,001 до 67,6±5,1, медиального – на 67,6 %, р≤0,01 до 56,7±4,5, дистального – в 3,2 раза, р≤0,001 до 79,8±6,4; в мышечном слое проксимального отдела в 4,5 раза, р≤0,001 до 60,6±5,9, медиального – в 3 раза, р≤0,001 до 77,3±7,1, дистального – в 2,1 раза, р≤0,001 до 33,7±3,1. К двенадцатисуточному возрасту наблюдается снижение более высоких показателей и увеличение малых. Так в тканях слизистого слоя в проксимальном отделе активность КФ составляет 50,5±4,5, что ниже на 25,3 %, р≤0,05, дистального 42,9±4,3, что ниже на 46,2 %, р≤0,01; в тканях мышечного слоя в медиальном отделе – 28,7±2,4, что ниже на 62,9 %, р≤0,001, дистальном – 53,0±4,7, что выше на 56,5 %, р≤0,01. К возрасту восемнадцати суток уровень фермента существенно увеличивается во всех слоях и отделах тощей кишки: в слизистом слое проксимального отдела на 59,6 %, р≤0,01 до 80,6±7,5, медиального – на 55,5 %, р≤0,01 до 81,4±7,6, дистального – на 92,6 %, р≤0,01 до 82,7±7,6; в мышечном слое проксимального отдела на 36,2 %, р≤0,05 до 78,0±5,3, медиального – в 3,4 раза, р≤0,001 до 96,9±8,4, дистального – на 55,3 %, р≤0,01 до 82,3±5,9. В дальнейшем отмечается временное снижение активности фермента. У двадцатичетырехсуточных крольчат в слизистом слое медиального отдела на 31,6 %, р≤0,05 до 55,7±4,9, дистального – на 31,6 %, р≤0,05 до 56,6±4,6, в мышечном слое проксимального отдела на 20,7 %, р≤0,05 до 61,9±4,3, медиального – на 62,4 %, р≤0,001 до 36,4±4,1, дистального – на 21,9 %, р≤0,05 до 64,3±4,0. Падение уровня КФ выявляется и к месячному возрасту крольчат: в тканях слизистого слоя проксимального отдела на 61 %, р≤0,001 до 26,6±1,9, медиального – 41,5 %, р≤0,01 до 32,6±2,9 %, р≤0,001 до 23,9±2,5; мышечного слоя проксимального отдела на 61,2 %, р≤0,001 до 24,0±2,2, медиально- го – на 50,6 %, р≤0,01 до 18,0±1,3, дистального – на 62,7 %, р≤0,001 до 24,0±2,1. У полуторамесячных животных отмечено снижение активности в слизистом слое дистального отдела (на 33,1 %, р≤0,05 до 16,0±1,2) и повышение в слизистом слое проксимального (на 59,7 %, р≤0,01 до 42,4±3,8) и мышечном слое проксимального (на 60,7 %, р≤0,01 до 38,6±3,3) и медиального отделов (в 2,5 раза, р≤0,001 до 44,1±4,1). К двухмесячному возрасту уровень фермента существенно увеличивается на протяжении всей кишки: в слизистом слое проксимального отдела в 2,1 раза, р≤0,001 до 87,4±6,4, медиального – в 2,3 раза, р≤0,001 до 77,1±6,5, дистального – в 4,6 раза, р≤0,001 до 73,7, мышечном слое проксимального – в 2,1 раза, р≤0,001 до 79,7±7,3, медиального – на 63,1 %, р≤0,01 до 72,0±6,9, дистального – в 3 раза, р≤0,001 до 62,6±5,6. У трехмесячных животных, по сравнению с предыдущим сроком, активность КФ значительно снижается в тканях слизистого слоя в проксимальном и медиальном отделах (соответственно, на 65,4 %, р≤0,001 до 30,3±2,8 и на 76,7 %, р≤0,001 до 18,0±1,6), в тканях мышечного слоя – во всех отделах (в дистальном направлении соответственно, на 64,2 %, р≤0,001 до28,5±2,5; на 70,6 %, р≤0,001 до 21,2±2,1; на 39,7 %, р≤0,01 до37,7±3,4). К четырехмесячному же сроку она вновь существенно возрастает во всех отделах. В слизистом слое проксимального отдела в 2,7 раза, р≤0,001, до 80,1±7,3, медиального – в 4,3 раза, р≤0,001, до 77,6±6,2, дистального – на 29 %, р≤0,05, до 80,1±5,8; в мышечном слое проксимального отдела в 2,9 раза, р≤0,001 до 81,4±6,4, медиального – в 3,6 раза, р≤0,001 до 76,3±7,1, дистального – на 59,1 %, р≤0,01 до 60,0±5,4.

Заключение. Таким образом, приведенные выше результаты исследований свидетельствуют о том, что крольчата рождаются с относительно высоким уровнем щелочной фосфатазы в тканях тощей кишки. Достаточно высоким он остается и в молочную фазу питания. Существенное снижение отмечается к двадцати четырех-и тридцати дневному возрасту, когда происходит переход крольчат с молочного на смешанный и растительный тип питания. При этом в целом, активность ЩФ в слизистом слое кишки выше, чем в мышечном. Это, по-видимому, связано с большей потребностью в данном ферменте при процессах всасывания питательных веществ и секреции пищеварительных ферментов.

Активность кислой фосфатазы в тканях тощей кишки на порядок ниже, чем щелочной. В первые сутки после рождения она не высокая, но затем с некоторыми колебаниями увеличивается. Также, как и в случае щелочной фосфатазы, значительное снижение уровня фермента прослеживается к двадцати четырех суточному и месячному возрасту, когда происходит приспособление к новой, существенно отличающейся пище, и следует полагать, перераспределение функциональной нагрузки в кишечнике. Следующее временное понижение активности фермента обнаруживается к трехмесячному сроку. К четырехмесячному возрасту стабилизации активности фермента КФ не происходит, уровень существенно возрастает во всех частях кишки, что возможно, связано с особенностями формирования и структуры кишки.