Активность синтеза РНК и ДНК в клеточных органеллах у сельскохозяйственных культур в связи с гетерозисом

Выявлению молекулярных механизмов, лежащих в основе гетерозисного эффекта, посвящены многочисленные исследования. В тканях у гибридных организмов на разных этапах развития изучали активность ряда ферментов (1-5), белковый полиморфизм (6-8), активность биосинтетических процессов (9-11), содержание биологически активных соединений (12), функциональную активность хлоропластов (13-17) и митохондрий (18-20).

Большое внимание уделялось оценке состояния наследственного аппарата при гетерозисе. В результате был установлен факт увеличения содержания нуклеиновых кислот в соматической клетке гетерозисных гибридов у пшеницы (21, 22), а в дальнейшем и у других сельскохозяйственных культур (23-25), что свидетельствует о наличии у таких гибридов механизмов регуляции, способствующих редупликации молекул ДНК, приводящей к соматической полиплоидизации ядер, образованию повторов и экстракопий ДНК в масштабе отдельных генетических локусов и всего генома (26, 27).

Пока что не имеется достаточно экспериментальных данных для разработки единой теории гетерозиса, поэтому любые исследования в этой области не утратили актуальности.

В настоящей работе была предпринята попытка дать комплексную характеристику изменениям в функциональной активности генетического аппарата у некоторых сельскохозяйственных культур с учетом локализации его компонентов в различных структурах клетки (ядрах, митохондриях, хлоропластах).

Методика. В исследовании использовали полученные в различных вариантах скрещивания сортов и образцов гетерозисные гибриды огурца

Cucumis sativus L. (Дин-зо-сн x Ива, Ива x Дин-зо-сн, Ива x Аньшан-ский, Кировабадский улучшенный x Щедрый 118, Парад x Щедрый 118), баклажана Solanum sp. (Ереванский 2 x г 10), кукурузы Zea mays L. (ГБ 2501 x МК 22, МК 22 x ОК 18, Bi 73 x ОК 18) и их родительские формы (гибриды огурцов и баклажанов были получены в Азербайджанском НИИ овощеводства, кукурузы — в Институте генетики и селекции АН Азербайджана). Образцы гибридов F 1 овощных культур и их родительских форм выращивали в условиях оранжереи, кукурузы — на опытном участке Института генетических ресурсов АН Азербайджана. В течение вегетационного периода проводили необходимые агротехнические обработки, выполняли фенологические наблюдения, учитывали продуктивность растений.

В фазу массового цветения в материале из листьев гибридных и родительских форм определяли массу одной клетки, содержание нуклеиновых кислот в клетках, структурное состояние ДНК, содержание РНК и ДНК в митохондриях и хлоропластах. Для учета числа клеток в образцах использовали модифицированный метод Брауна (28).

Митохондрии из листьев выделяли дифференциальным центрифугированием очищенного гомогената ткани на холоду (при +4 ° C) в калийфосфатном буфере ( 1 / 15 М, рН 7,4), содержащем сахарозу (0,5 М) и EDTA (0,005 М) (соотношение объема растительного материала и среды для центрифугирования — 5:1). Гомогенат отжимали через двойной слой полотна и центрифугировали 15 мин при 3000 g для удаления ядер, пластид, клеточных оболочек и других фрагментов. Супернатант для осаждения митохондрий центрифугировали 20 мин при 8000-9000 g. Полученный осадок суспендировали в калий-фосфатном буфере ( 1 /₁₅ М, рН 7,0) с сахарозой (0,5 М). Чистоту препарата митохондрий оценивали энзиматически (29). Полученную суспензию митохондрий использовали для определения нуклеиновых кислот. Хлоропласты выделяли в среде, содержащей сахарозу (0,4 М), Трис-HCl буфер (0,05 М, рН 7,4), NaCl (0,01 М) и MgCl₂ (0,03 M). Гомогенат отжимали через двойной слой полотна и центрифугировали 5 мин при 200 g для удаления ядер, клеточного дебриса и других фрагментов. Супернатант центрифугировали 15 мин при 1500 g. Надосадочную жидкость удаляли, осадок хлоропластов ресуспендировали в той же среде и снова центрифугировали при указанных выше оборотах; процедуру повторяли дважды. Чистоту препарата хлоропластов контролировали под световым микроскопом. Выделенные хлоропласты и митохондрии обрабатывали этиловым спиртом до получения бесцветного фильтрата, затем промывали холодной дистиллированной водой, 0,2 н. хлорной кислотой, снова дистиллированной водой, еще раз этиловым спиртом, смесью этилового спирта и серного эфира (1:1) и эфиром.

Общее количество нуклеиновых кислот в растительных клетках устанавливали по методу R.H. Nieman и Z.L. Poulsen (30). Содержание нуклеиновых кислот в митохондриях и хлоропластах определяли спектрофотометрически по Шмидту-Тангаузеру в модификации В.Г. Конарева (31). Для изучения фракционного состава ДНК осуществляли ступенчатое воздействие на хроматин растворами разной ионной силы и проводили его депротеинизацию, что позволяло разделять клеточную ДНК на свободную или слабосвязанную, функционально активную (лабильная ДНК); полностью блокированную гистонами (стабильная ДНК); прочно связанную (остаточная ДНК) (32).

Данные анализов обрабатывали статистически (33).

Результаты . В первой серии исследований было изучено общее содержание нуклеиновых кислот у родительских и гибридных форм овощ-38

ных культур, при этом основное внимание уделялось оценке этого показателя в расчете на клетку (табл. 1). В трех изученных гибридных комбинациях использовали сорт огурца Ива, который в качестве материнской формы скрещивался с сортами Дин-зо-сн и Аньшанский, в качестве отцовской — с сортом Дин-зо-сн.

1. Продуктивность и содержание нуклеиновых кислот в листьях у гибридов овощных культур и их родительских форм

Сорт, гибрид	Продуктивность одного растения, кг	Содержание на сухую массу листа, мг% ( X ± х )	РНК/ДНК	Содержание на клетку, х10 9 ' г		Масса клетки, х|0 9 г	Число клеток, х106
		РНК I ДНК		РНК 1	ДНК
	Огурец Cucumis		s a t i v u s L.
Дин-зо-сн	2,50	1553,7±14,2 70,4±0,2	22,08	26,7	1,21	1,73	57,20
Ива	1,60	1550,5±14,0 71,8±2,5	21,60	24,5	1,13	1,58	64,70
Аньшанский	2,25	1511,3±24,4 50,1±0,6	30,15	29,9	0,99	1,98	43,43
Дин-зо-сн х Ива (гетерозис, %)	3,38 (35,2)	1588,0±15,3 88,1±1,6	18,02	25,6	1,97	2,24	39,50
Ива х Дин-зо-сн (гетерозис, %)	2,80 (12,0)	1341,0±28,1 86,2±4,1	15,56	27,5	1,77	2,05	46,00
Ива х Аньшанский (гетерозис, %)	2,38      1324,3±13,6 57,7±1,1 (5,8) Баклажаны Solanum		22,95      38,8 melongena L.		1,69	2,93	40,16
Ереванский 3	1,30	564,7±10,1 43,2±0,6	13,08	29,6	2,26	5,24	25,65
Г 10	0,50	608,2±4,5  32,7±0,3	18,59	34,1	1,83	5,60	22,19
Ереванский 3 х Г 10 (гетерозис, %)	1,60 (23,0)	566,7±5,8   39,6±0,6	14,31	34,2	2,43	6,15	20,45

Гибрид Дин-зо-сн х Ива характеризовался как наиболее продуктивный и высокогетерозисный, в варианте, где сорт Ива служил материнской формой, продуктивность снижалась. Комбинация Ива х Аньшанский оказалась самой низкоурожайной и низкогетерозисной.

По количеству РНК в расчете на сухую массу листа все три взятые в исследование сорта не различались между собой и высокогетерозисный гибрид Дин-зо-сн х Ива имел практически тот же показатель. У двух других гибридов (Ива х Дин-зо-сн и Ива х Аньшанский) содержание РНК снижалось приблизительно на 15 % по сравнению с таковым у родительских сортов. У прямого и обратного гибридов при скрещивании сортов Дин-зо-сн и Ива количество ДНК в расчете на сухую массу листа было выше, чем у родительских форм, приблизительно на 20 %, а у низкогетерозисной гибридной комбинации Ива х Аньшанский оказалось промежуточным относительно показателей у родительских форм, уклоняясь в сторону худшего из родителей. У всех гибридов отношение РНК/ДНК было ниже, чем у родительских сортов.

При оценке содержания нуклеиновых кислот в расчете на клетку листа установили, что у высокогетерозисного гибрида Дин-зо-сн х Ива количество РНК оказалось промежуточным по сравнению с зарегистрированным у родительских сортов. У менее продуктивного обратного гибрида количество РНК в расчете на клетку было несколько выше. Но следует отметить, что у сортов Дин-зо-сн и Ива, а также у их прямого и обратного гибридов этот показатель был приблизительно одинаковым. Сорт Аньшанский характеризовался наиболее высоким количеством РНК в расчете на клетку, а у низкогетерозисного гибрида Ива х Аньшанский анализируемый показатель превышал аналогичный у лучшего из родителей приблизительно на 30 %.

Для всех гибридных комбинаций отмечалось увеличение содержания ДНК в расчете на одну клетку листа. Причем для высокогетерозисного гибрида Дин-зо-сн х Ива оно составило приблизительно 63 % от зафиксированного у лучшей по этому показателю формы — сорта Дин-зо- сн, у двух других гибридов (Ива х Дин-зо-сн и Ива х Аньшанский) с меньшим эффектом гетерозиса — приблизительно 50 % от величины у лучшей по этому параметру родительской формы для каждой комбинации скрещивания. При этом у гибридов огурца число клеток на единицу площади листа уменьшалось, а размер самих клеток увеличивался.

Изучение всех вышеназванных показателей у баклажана сортов Ереванский 3 и Г 10 и гибрида, полученного при их скрещивании, выявило те же закономерности. По содержанию РНК (в расчете как на сухую массу листа, так и на одну клетку) гибрид не превосходил родительские формы. По содержанию ДНК в расчете на сухую массу гибрид также занимал промежуточное положение относительно родительских сортов. Однако определение количества ДНК в расчете на клетку позволило выявить преимущество гибрида по этому параметру. Число клеток на единицу площади у гибрида уменьшалось, тогда как сами клетки становились крупнее.

Следовательно, изучение содержания нуклеиновых кислот у овощных культур показало, что количество РНК в расчете как на сухую массу листа, так и на одну клетку у гетерозисных гибридов изменялось по-разному — могло превышать таковое у лучшего родительского сорта, занимать промежуточное положение между показателями у родительских сортов и, наконец, снижаться по сравнению с последними. Вероятно, содержание РНК зависит от того, на каком этапе онтогенетического развития находится растение: очевидно, что в активно метаболизирующей ткани оно будет наиболее высоким.

Количество ДНК в расчете на сухую массу листа у всех гибридных комбинаций овощных культур имело некоторую тенденцию к увеличению или сохранялось на уровне значений у лучшего из родителей. Расчет отношения РНК/ДНК показал, что у всех гибридов оно уменьшалось. Однако в пересчете на клетку количество ДНК у всех гибридных комбинаций, как оказалось, становилось выше, чем у родительских форм, поскольку у гибридов клетки крупнее, а их число на единицу площади листа меньше.

Далее нам представлялось важным исследовать фракционный состав ДНК у родительских форм и их гетерозисных комбинаций. В этой серии исследований общее содержание нуклеиновых кислот пересчитывали на сырую массу растительного материала (табл. 2).

2. Содержание РНК и фракций ДНК (на сырую массу, мг%) в тканях листа у гибридов огурца и кукурузы и их родительских форм ( X ± х )

Сорт, образец, гибрид	РНК	Фракция ДНК				РНК/ДНК
		лабильная	стабильная	остаточная |	всего
	Огурец Cucum		is sativus	L.
Кировабадский улучшенный	175,3±1,9	3,70±0,02	6,60±0,10	0,40±0,03	10,7	16,4
Щедрый 118	160,4±2,0	4,00±0,05	6,30±0,02	1,40±0,01	11,7	13,7
Кировабадский улучшен-
ный х Щедрый 118	213,9±1,1	5,20±0,04	7,40±0,15	1,40±0,01	14,0	15,3
Парад	170,4±0,9	2,40±0,07	6,40±0,05	0,70±0,03	11,5	14,8
Щедрый 118	160,4±2,0	4,00±0,05	6,30±0,02	1,40±0,01	11,7	13,7
Парад х Щедрый 118	165,5±1,5	4,50±0,10	7,00±0,06	0,70±0,03	12,2	13,6
	Кукуруза Z		e a mays L.
ГБ 2501	101,8±2,4	8,00±0,02	6,80±0,01	1,20±0,02	16,0	6,4
МК 22	86,9±2,7	7,10±0,08	8,40±0,02	1,20±0,03	16,8	5,2
ГБ 2501 х МК 22	138,7±1,8	8,10±0,02	9,50±0,05	1,30±0,01	18,9	7,3
МК 22	86,9±2,7	7,10±0,08	8,40±0,02	1,20±0,03	16,8	5,2
ОК 18	127,0±0,2	5,80±0,03	6,90±0,03	1,00±0,02	13,7	9,3
МК 22 х ОК 18	149,5±0,9	7,50±0,05	8,50±0,07	1,10±0,03	17,2	8,7
Bi 73	113,5±0,2	5,60±0,02	6,10±0,03	0,50±0,02	12,2	9,3
ОК 18	127,0±0,2	5,80±0,03	6,90±0,03	1,00±0,02	13,7	9,3
Bi 73 х ОК 18	116,1±0,4	7,50±0,06	6,20±0,02	1,10±0,02	14,8	7,8

Из приведенных данных следует, что у всех изученных вариантов огурца тотальная ДНК была представлена главным образом стабильной формой, содержание которой колебалось в пределах 52,9-67,4 %. На долю лабильной ДНК приходилось 25,2-36,9 %. Остальная ДНК определялась в виде остаточной фракции.

Гибрид огурца Кировабадский улучшенный х Щедрый 118 превосходил родителей по содержанию РНК и суммарной ДНК. Содержание РНК у этой гибридной комбинации составляло 213,9 мг% против соответственно 175,3 и 160,4 мг%, ДНК — 14,0 мг% против 10,7 и 11,7 мг% у родительских форм. Высокое содержание тотальной ДНК в листьях у гибрида огурца было обусловлено увеличением как ее лабильной, так и стабильной фракции. Равномерный рост количества лабильной и стабильной ДНК связан, по-видимому, с образованием многочисленных эндополиплоидных клеток в гибридном организме. У гибрида огурца Парад х Щедрый в сравнении с родительскими сортами также отмечалось увеличение количества тотальной ДНК за счет ее лабильной и стабильной фракций. Подобный факт может свидетельствовать в пользу утверждения, что скрещивание не приводит к простому суммированию родительских свойств. Вероятно, при гибридизации генетический аппарат начинает функционировать так, чтобы обеспечить более активный синтез необходимых пластических веществ, например благодаря транскрипции с большего числа копий при неизменной скорости ферментативных реакций. Увеличение количества генетического материала за счет эндополиплоидии создает условия для усиления биосинтетических процессов у гибридов.

Определение содержания РНК и фракционного состава ДНК у кукурузы подтвердило выводы исследований на огурце. Изученные гибриды кукурузы по состоянию ДНК и синтезу РНК также значительно отличались от родителей, характеризуясь высоким содержанием нуклеиновых кислот. У гибридов ГБ 2501 х МК 22 и МК 22 х ОК 18 количество суммарной ДНК увеличивалось за счет как лабильной, так и стабильной фракции, у гибрида Bi 73 х ОК 18 — за счет лабильной фракции.

Однако генетическая программа растительной клетки реализуется не только на уровне ядерного генома. Важную роль в энергообеспечении играют митохондрии и хлоропласты, и изменение генетического материала у этих клеточных структур при гибридизации позволяет оценить энергоемкость изучаемых систем.

3. Содержание нуклеиновых кислот в митохондриях и хлоропластах (на сухое вещество цитоплазматических органелл, мг%) у гибридов огурца и кукурузы и их родительских форм ( X ± х )

Сорт, образец, гибрид	Митохондрии			Хлоропласты
	РНК	ДНК 1РНК/ДНК		РНК	ДНК	РНК/ДНК
Кировабадский улучшенный	Огурец 2500,6±12,2	Cucumis 588,5±2,5	sativus 4,3	L. 1122,4±9,3	133,3±1,2	8,4
Щедрый 118	2003,8±14,9	438,9±15,3	4,6	841,8±8,2	108,4±0,8	7,8
Кировабадский улучшенный х Щедрый 118	2359,6±8,0	585,2±2,2	4,0	1316,6±8,7	156,4±1,6	8,4
Парад	2071,7±17,3	445,9±6,9	4,6	993,6±6,0	168,7±1,9	5,9
Щедрый 118	2003,8±14,9	438,9±15,3	4,6	841,8±8,2	108,4±0,8	7,8
Парад х Щедрый 118	2045,2±8,0	440,7±9,5	4,6	1025,0±5,3	169,9±1,5	6,0
Bi 73	Кукуруза Zea 1549,6±4,8 277,3±6,1		mays L. 5,6	1785,2±12,0	405,1±3,0	4,4
OK 18	1610,8±4,8	163,7±1,5	9,8	2090,5±71,5	365,3±1,4	5,7
Bi 73 х OK 18	2013,3±2,2	260,0±1,6	7,7	2495,2±15,0	382,5±8,4	6,5
Bi 73	1549,6±4,8	277,3±6,1	5,6	1785,2±12,0	405,1±3,0	4,4
МК 22	1950,3±3,0	198,7±2,3	9,8	2673,7±19,4	345,9±2,0	7,7
Bi 73 х МК 22	1959,5±1,1	299,6±13,1	6,5	2241,9±18,5	390,9±2,1	5,7

По содержанию митохондриальной РНК гибридные комбинации огурца занимали среднее положение относительно исходных компонентов, по содержанию митохондриальной ДНК — приближались к лучшей по этому показателю родительской форме (табл. 3). Что же касается хлоропластной РНК, то обе гибридные комбинации по этому показателю превосходили соответствующие родительские сорта: гибрид Кировабадский улучшенный х Щедрый — на 74,2 %, гибрид Парад х Щедрый 118 — на 11,7 %. Такое же резкое различие между гибридами и родительскими формами наблюдалось по содержанию хлоропластной ДНК. Для обеих гибридных комбинаций оно было выше средних показателей у родителей соответственно на 35,6 и 31,4 мг% сухого вещества хлоропластов. Это свидетельствует о лучшей энергообеспеченности гибридов огурца по сравнению с родительскими сортами за счет повышения функциональной активности хлоропластной системы.

Изучение цитоплазматических генетических систем у кукурузы показало, что у исследуемых гибридов этой культуры (в отличие от огурца) подобной активации синтеза нуклеиновых кислот в хлоропластах не происходит. Так, Bi 73 х МК 22 занимал промежуточное положении относительно родителей по содержанию нуклеиновых кислот, Bi 73 х ОК 18 — промежуточное положение по количеству хлоропластной ДНК.

В то же время у гибридов кукурузы активировался синтез нуклеиновых кислот в митохондриях. Так, увеличение количества митохондриальной РНК у Bi 73 х ОК 18 составило 27,4 %, у Bi 73 х МК 22 — 12,0 % по сравнению с отмеченным у родителей. При этом по уровню синтеза митохондриальной ДНК гибрид Bi 73 х ОК 18 приближался к лучшей по этому показателю родительской форме, а Bi 73 х МК 22 превосходил материнскую и отцовскую форму соответственно на 22,3 и 100,9 мг%.

Следовательно, изучение цитоплазматических генетических систем у гетерозисных гибридов огурца и кукурузы показало, что у первой культуры они превосходили родительские сорта по количеству нуклеиновых кислот в митохондриях. Это может указывать на высокую функциональную активность митохондриального генома клетки, что, в свою очередь, способно стать предпосылкой для высокой скорости энергетических и пластических процессов в этих органеллах у гибридных комбинаций. Напротив, у гетерозисных гибридов кукурузы по сравнению с родителями выше количество генетического материала в хлоропластах, что, вероятно, повышает активность пластических и энергообразующих процессов в них.

Таким образом, комплексный подход к изучению функционального состояния ядерного, митохондриального и хлоропластного генома позволил получить более полное представление о реализации активности указанных структур при проявлении гетерозисного эффекта. У всех изученных гибридных комбинаций (независимо от видовой принадлежности) содержание ДНК в тканях листа в расчете на клетку выше, чем у родительских сортов. При этом происходит уменьшение числа клеток на единицу площади листовой поверхности, в то время как размер самих клеток увеличивается. Установление наиболее общих закономерностей перестройки генетического аппарата у гибридов дает возможность обоснованно рекомендовать определение содержания ДНК в отдельной соматической клетке для прогнозирования гетерозисного эффекта. У гетерозисных гибридов в общую повышенную энергообеспеченность клетки могут вносить вклад и митохондриальная, и хлоропластная система, в чем, возможно, и заключается их комплементарное взаимодействие. Кроме того, имеются основания полагать, что в том случае, если ядерная, митохондриальная и хлоропластная генетические системы клетки растения функционируют с повышенной нагрузкой, у гибрида, который при этом получает больше энергии для усиления процессов биосинтеза пластических веществ, мож- но, как следствие, ожидать проявления высокого гетерозисного эффекта.

Автор благодарит сотрудников Азербайджанского НИИ овощеводства за помощь в определении гетерозисного эффекта у гибридов огурца и баклажана, а также коллег по Институту генетики и селекции АН Азербайджана за выполнение работ по оценке гетерозиса у гибридов кукурузы.