Активность супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах нетренированных крыс в плавательном тесте «до отказа»

Введение. Физическая нагрузка разной интенсивности является распространенным методом исследования работоспособности, выносливости организма [1]. Физическая нагрузка до истощения, нагрузка на выносливость - это физиологический стресс, который сопровождается увеличением активных форм кислорода (АФК) [2], играющих роль сигнальных молекул при включении адаптационных механизмов [3].

Механизмы адаптации к физической нагрузке в нетренированном организме (срочная адаптация) отличаются от таковых в тре нированном (долговременная адаптация) тем, что на начальной стадии процесса приспособления к физической нагрузке окислительный стресс может привести к деструкции клеток тканей [3, 4]. Например, физическая нагрузка способствует метаболическим и структурным изменениям в эритроцитах в зависимости от ее интенсивности и продолжительности [5].

Сохранению функциональности и целостности эритроцитов способствует антиоксидантная система (АОС) [6]. Ключевым ферментом АОС является супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1), прерывающая цепь сво- боднорадикальных процессов в начале своего зарождения на стадии одноэлектронного восстановления кислорода с образованием супероксидного анион-радикала [3]. Глутатионпероксидаза (ГП, КФ 1.11.1.9) катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов и перекиси водорода [3]. Наличие в цитозоле эритроцитов фермента глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы (Г-6-ФДГ, КФ 1.1.1.49) обеспечивает восстановление НАДФ до НАДФН, необходимого для перехода окисленного глутатиона в восстановленную форму и связывания АФК/пе-рекисей, а также для поддержания тиоловых групп белков и ферментов в восстановленном состоянии, что особенно важно в условиях окислительного стресса [7]. Активность ферментов АОС взаимосвязана и сбалансирована, а их кооперативное действие необходимо для защиты клеток тканей от АФК [3].

В литературе имеются данные о влиянии физических нагрузок разной интенсивности и длительности на активность ферментов АОС крови [8] и тканей [9, 10] у человека и животных. Активность Г-6-ФДГ при различных режимах физической нагрузки изучается в основном у человека с пониженной активностью фермента [11]. Однако описывается значение этого фермента как ключевого в функционировании пентозофосфатного пути при адаптации к окислительному стрессу [12].

Таким образом, исследование активности ферментов АОС, способствующих повышению функциональности эритроцитов при адаптации организма к физической нагрузке, является одной из актуальных задач при изучении физиологических механизмов в обеспечении физической работоспособности.

Цель исследования. Изучение влияния однократной физической нагрузки разной интенсивности на активность СОД, ГП и Г-6-ФДГ эритроцитов крыс.

Материалы и методы. В работе использовали трехмесячных самцов крыс линии Wistar (масса тела 250-300 г). Животных содержали по 4 особи в клетке на стандартном рационе вивария, с доступом к воде ad libitum, при температуре 21±1 °С и 12-часовом освещении. Доступ к пище прекращался не менее чем за два часа до эксперимента. Протокол ис- следования одобрен этическим комитетом Института физиологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН.

Животные случайным образом были разделены на семь групп: интактные крысы (ви-варный контроль (ВК)); животные, плававшие 60 мин без дополнительного веса (нагрузка умеренной интенсивности (УН)); четыре группы животных, участвующих в нагрузочном тестировании: низко интенсивная физическая нагрузка (НИ) - плавание с грузом 2 % от массы тела, высоко интенсивная физическая нагрузка (ВИ) - плавание с грузом 8, 10 и 15 % от массы тела (ВИ8, ВИ10 и ВИ 15 соответственно). Животные седьмой группы (ОС) в течение 60 мин находились на мелководье при температуре 28,5±0,2 ºС без возможности плавать с целью вызвать окислительный стресс без физической нагрузки [13]. Все животные, за исключением групп ВК и ОС, предварительно проходили адаптацию к воде и плаванию, т.е. крысы плавали по 30 мин через день два раза [13] с последующим восстановлением через 10–14 дней для нивелирования эффекта тренировки. Крысы плавали в баке (h=55 см, d=40 см), заполненном десатурированной водой, чтобы избежать нежелательного влияния пузырьков газа на плавучесть животных. Для того чтобы исключить влияние температурного фактора при оценке физической работоспособности использовалась вода термонейтрального диапазона для лабораторных животных (28,5±0,2 ºС) [14]. Высота столба воды составляла 40 см. После взвешивания животного металлическое кольцо фиксировали у основания хвоста эластичной нетравмирующей лентой, включение секундомера осуществляли в момент помещения животного в воду. Основными критериями развития полного утомления являлись три безуспешные попытки всплыть на поверхность или нахождение под водой более 10 с, сопровождавшееся опусканием на дно. Далее животное извлекали из воды, быстро обсушивали, декапитировали.

Определение активности СОД в смешанной крови проводили по методу [15], основанному на ингибировании реакции восстановления нитротетразолия синего в формазан (гид-разинтетразолий) супероксидными анион-ра-дикалами кислорода, генерируемыми систе- мой «NADН-феназинметасульфат». Активность ГП определяли по убыли восстановленного глутатиона при его окислении гидроперекисью трет-бутила [16]. Активность Г-6-ФДГ в эритроцитах оценивали кинетическим методом с использованием коммерческих наборов (Sentinel, Италия) по скорости восстановления НАДФ до НАДФН, содержание которого регистрировали при длине волны 340 нм.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel и «Биостат» (версия 4.03). Различия считали значимыми при p<0,05 по критерию Крускала–Уоллеса и критерию Данна для непараметрических выборок.

Результаты. Результаты фактического времени плавания крыс «до отказа» показали, что чем тяжелее груз, тем быстрее сокращается время плавания. С дополнительным грузом 8 % плавание длилось 2,98±0,89 мин, 10 % – 2,0±0,33 мин, 15 % – 1,53±0,1 мин. Крысы с грузом 2 % разделились на две подгруппы по продолжительности плавания: 48,35±8,19 мин (n=3) и 289,33±47,12 мин (n=3).

Анализ полученных данных показал, что активность СОД в эритроцитах различалась в обследуемых группах животных (табл. 1). Наибольшее значение активности фермента зафиксировано у контрольных крыс (ВК), а наименьшее – у крыс ОС (p<0,01). У крыс, плававших с утяжелением, активность СОД достоверно ниже по сравнению с животными из группы ВК (p<0,05) и достоверно выше по сравнению с группой ОС только у ВИ8 (p<0,01), ВИ10 (p<0,01), ВИ15 (p<0,05).

Активность ГП у крыс ВК была минимальная, у крыс ОС – максимальная (p<0,05) (табл. 1). У крыс с умеренной, низко- и высокоинтенсивной нагрузкой наблюдалось снижение активности ГП относительно ОС. Статистически значимые различия активности фермента выявлены между ОС и ВИ8 (p<0,05).

Изменение активности Г-6-ФДГ сходно с изменением активности ГП (табл. 1). Наименьшая активность фермента выявлена у животных в контроле, наибольшая – у животных из групп ОС и УН (p<0,05).

Таблица 1

Table 1

Активность ферментов в эритроцитах крыс в плавательном тесте «до отказа» (M±SD)

Enzyme activity in rats’ erythrocytes in “to-muscular-failure” swimming test (M±SD)

Показатель Indicator	ВК Vivarium control	Экспериментальные группы Experimental groups
		ОС Oxidative stress	УН Moderate load	НИ Low intensity load	ВИ8 High intensity load (8)	ВИ10 High intensity load (10)	ВИ15 High intensity load (15)
СОД, у.е./Hb	0,641±0,15	0,406±0,14	0,426±0,11	0,452±0,11	0,484±0,06	0,472±0,04	0,501±0,08
SOD, standard		**	**	**	**##	**##	*#
units/Hb	(n=16)	(n=7)	(n=10)	(n=6)	(n=6)	(n=6)	(n=6)
ГП,	585,05±	1042,25±	830,13±	696,27±	639,83±	827,51±	847,09±
мкМ/Hb	±125,5	±343,46	±152,47	±95,03	±149,27	±308,4	±284,75
GP,		*	*		#
µmol/ Hb	(n=7)	(n=6)	(n=8)	(n=6)	(n=7)	(n=6)	(n=5)
Г-6-ФДГ, мЕ/109	463,40±	1226,93±	1233,69±	718,57±	693,61±	775,55±	716,37±
эритроцитов	±108,26	±430,26	±564,31	±213,24	±135,48	±338,79	±189,70
G-6-FDH,		*	*	*#	*#	*	*
mU/109 erythrocytes	(n=5)	(n=5)	(n=5)	(n=5)	(n=5)	(n=5)	(n=5)

Примечание. * – различия достоверны по сравнению с ВК при p<0,05, ** – при p<0,01; # – различия достоверны по сравнению с ОС при p<0,05, ## – при p<0,01.

Note. * – the differences are significant compared with the control group, p<0.05, ** – the differences are significant compared with the control group, p<0.01; # – the differences are significant compared with the oxidative stress, p<0.05, ## – the differences are significant compared with the oxidative stress, p<0.01.

Активность Г-6-ФДГ эритроцитов у крыс с низкоинтенсивной нагрузкой значимо не различалась по сравнению с группами высокоинтенсивной нагрузки (табл. 1).

Обсуждение. Анализ полученных данных свидетельствует об изменении активности ферментов АОС эритроцитов в зависимости от физиологического состояния животных. Животные из группы ОС были помещены в небольшое количество воды, где они большую часть времени стояли неподвижно, изредка опираясь передними лапами на стенку бака. Затем, чтобы оценить степень метаболических изменений, в частности в эритроцитах, возникающих в организме крыс при погружении в воду, они помещались в бак с водой, что для них является фактором стресса [13]. Вероятно, неподвижность, неадаптированность к воде и длительность воздействия (один час) явились причиной снижения активности СОД и повышения активности ГП и Г-6-ФДГ относительно контроля в результате повышенного образования АФК. Одной из причин снижения активности СОД является избыточное количество перекиси водорода, которая приводит к угнетению активности фермента [17]. Однако модификация СОД, приводящая к снижению активности энзима, предотвращается глутатионом [18]. Повышение активности ГП может быть связано с повышенным использованием восстановленного глутатиона [3]. В литературе есть данные о том, что избыточное количество перекиси водорода приводит к повышению активности пентозо-фосфатного пути [19]. В работе А.В. Макеевой и соавт. показано увеличение активности Г-6-ФДГ в условиях активации окислительного стресса на 70 % от контроля [20].

Таким образом, в результате острого стрессового воздействия в течение 60-минутного пребывания в воде показатели активности СОД, ГП, Г-6-ФДГ в эритроцитах свидетельствуют о развитии окислительного стресса у крыс в группе ОС.

Тест принудительного плавания как метод оценки выносливости (работоспособности) представляет собой комбинированный вид стресса, сочетающий эмоциональный стресс [21] и аэробно-анаэробную физическую нагрузку как физиологический стресс

[2, 13]. Плавательная нагрузка крыс в течение 60 мин является наиболее распространенным протоколом в исследовании влияния физических нагрузок, так как предполагается, что она не вызовет значительный рост маркеров окислительного стресса, но повысит эндогенную антиоксидантную защиту, поскольку является нагрузкой умеренной интенсивности [8]. В литературе есть данные о том, что регулярные умеренные физические упражнения ослабляют окислительный стресс [8, 22]. Представленные показатели активности СОД, ГП и Г-6-ФДГ (табл. 1) в эритроцитах крыс относительно контроля свидетельствуют о том, что у животных наблюдается окислительный стресс, вызванный однократной физической нагрузкой умеренной интенсивности. Возможно, однократное воздействие физической нагрузкой умеренной интенсивности приводит к окислительному повреждению клетки вследствие «ограниченного адаптивного ответа» [23]. В пользу данного предположения свидетельствуют результаты исследования М.В. Балыкина и соавт., в котором показано, что не только однократные, но и повторяющиеся физические плавательные нагрузки в первые пять суток наблюдения сопровождаются снижением активности СОД и каталазы в миокарде крыс [24].

Согласно методическим рекомендациям [14] плавание с грузом 2,5-3,0 % от массы тела относится к низкому уровню нагрузок большой длительности (аэробный режим). Известно, что при динамической работе утомление наступает медленнее, чем при статической, из-за лучшего кровотока вследствие чередования сокращения и расслабления мышц. Достаточное кровоснабжение работающих мышц позволяет выполнять умеренную работу довольно долго. Полученные данные показывают, что у крыс могут быть значительные различия в их реакции на физическую нагрузку, так крысы НИ по времени плавания разделись на две подгруппы: одни плавали 30-60 мин, другие - 200-350 мин. Надо отметить, что активность СОД и ГП независимо от продолжительности плавания у всех животных этой группы была практически на одном уровне. Изменения активности изучаемых ферментов позволяют говорить о достоверном снижении окислительного стресса в группе НИ: активность СОД значимо повысилась по сравнению с ОС (p<0,05), а активность ГП снизились, приближаясь к контрольным показателям. В работе T. Kawamura, I. Muraoka сообщается, что физиологический механизм, за счет которого происходит увеличение окислительного стресса при повышении интенсивности или длительности физической нагрузки, неизвестен [25].

Плавание с грузом 8, 10 и 15 % – это высокоинтенсивная физическая нагрузка в анаэробном режиме [14]. Уровень активности ферментов АОС эритроцитов между группами крыс, плававших с грузом 8, 10 и 15 %, статистически значимо не различался. Интересно отметить, что для групп НИ и ВИ8 общим является характер изменения активности СОД, ГП и Г-6-ФДГ (табл. 1). Одинаковый результат при разных режимах физической нагрузки достигнут за разный промежуток времени. Вероятно, развитие окислительного стресса во время анаэробной нагрузки происходит быстрее, чем во время аэробной. Данные, полученные в группе нетренированных молодых мужчин, показывают, что в плазме изменения активности СОД и ГП в анаэробных условиях фиксируются через 5 мин, а в аэробных – через 20 мин [26]. Предположительно, что для усиления окислительного стресса более важную роль играет интенсивность физической нагрузки, а не ее продолжительность [27].

Заключение. При воздействии однократной физической нагрузкой разной интенсивности наблюдается снижение активности СОД и повышение активности ГП, Г-6-ФДГ относительно контроля; не выявлены различия активности СОД и Г-6-ФДГ между группами крыс; показана тенденция к повышению активности ГП в зависимости от интенсивности нагрузки.