Активность свободнорадикальных процессов в ротовой жидкости пациентов с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей

Submitted 10.04.2021                         Revised 12.06.2021                        Published 30.06.2021

<линическая 2021 п эакти keu Том 12 №2

Наиболее доступными для этого являются методы, основанные на определении не самих радикалов, а продуктов реакций с их участием, — гидроперекисей липидов, первичных, вторичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), например спектрофотометрическое определение продуктов окислительных превращений гидроперекисей липидов [7]. Оценку антиоксидантной компоненты системы ПОЛ/АОЗ проводят по активности супероксиддисмутазы, каталазы и уровню церулоплазмина [5, 8].

Сложные взаимодействия между различными компонентами про-/антиоксидантной системы наталкивают на поиски интегральных показателей, позволяющих произвести суммарную (комплексную) оценку про- и антиоксидантной активности биологических жидкостей [4, 5, 8–12]. Для интегральной оценки антиоксидантного эффекта чаще всего используется принцип «система генерации радикалов–«перехватчик»–детектирование». Роль «перехватчика» выполняет биологический материал, который при введении в радикалообразующую систему приводит к уменьшению свободных радикалов, на основании чего и определяется его (биоматериала) антиоксидантная активность. В зависимости от характера реакции и типа продуктов в оценке скорости антиоксидантной активности используются флюорометрические, люминомет-рические, хроматографические и хемилюминесцентные методы [10, 12, 13]. Метод хемилюминесценции основан на том, что взаимодействие радикалов друг с другом сопровождается выделением энергии, излучаемой в виде квантов света. Метод высокочувствителен, позволяет оценивать высокореакционные свободные радикалы и продукты их воздействия, которые оказываются в возбужденном состоянии. Кроме того, метод люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) позволяет определить характер расстройств и степень компенсации в системе про-/антиокси-дантов [11–14].

Выбор биологического материала зависит от характера и локализации патологического процесса [1, 4–6, 9]. При локализации воспалительного процесса в полости рта и верхних дыхательных путях информативным является исследование ротовой жидкости (РЖ) [5, 9, 13].

Цель исследования — оценить параметры свободнорадикального окисления ротовой жидкости пациентов с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено ретроспективное исследование.

Критерии соответствия

Критерии включения в наблюдаемую группу : пациенты с инфекциями верхних дыхательных путей с частотой рецидивирования более 4 раз в год (МКБ-10: J00–J06, J31–32, J35, J37) в период клинической ремиссии. Санированная полость рта (по данным обследования у стоматолога). Согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения :

• 1)    тяжелая сопутствующая патология:

• •    ишемическая болезнь сердца: стабильная стенокардия напряжения, функциональный класс III–IV; инфаркт миокарда; атеросклеротический кардиосклероз; артериальная гипертензия II– III степени, риск IV; сердечно-сосудистая недостаточность IIБ–III;

• •    ишемические и реперфузионные поражения почек, головного мозга (острое нарушение мозгового кровообращения) и других тканей, облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей;

• •    тяжелая бронхолегочная патология (эмфизема, астма, острая и хроническая дыхательная недостаточность II–III);

• •    острые и хронические заболевания печени (цирроз, гепатиты), почек (острая и хроническая почечная недостаточность);

• •    сахарный диабет;

• •    злокачественные новообразования;

• •    острая стадия инфекционно-воспалительных заболеваний;

• •    ВИЧ-инфицированные;

• •    подтвержденный первичный иммунодефицит;

• •    острая стадия инфекционно-воспалительных заболеваний;

• •    инфекционно-воспалительные заболевания полости рта и зубов;

• •    период обострения заболеваний желудочно-кишечного тракта;

• 2)    курящие и злоупотребляющие алкоголем;

• 3)    отказ от участия в исследовании.

Условия проведения

Исследование выполнялось на базе ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека» (г. Гомель, Республика Беларусь) в период 2018-2019 гг. Все

обследуемые лица обращались к иммунологу по поводу рецидивирующих инфекций верхних дыхательных путей.

Описание медицинского вмешательства

Ротовую жидкость собирали утром (с 9.00 до 10.00), натощак, до чистки зубов, после ополаскивания полости рта кипяченой водой путем сплевывания в чистую сухую пробирку, без стимуляции.

Методы регистрации исходов

После сбора ротовую жидкость центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об./мин. Надосадочную жидкость применяли для дальнейших исследований. Полученный таким образом биоматериал делили на две части. В одной из них спектрофотометрически определяли содержание первичных (диеновые конъюгаты, ДК), промежуточных (сопряженные триены, СТ) и конечных (основания Шиффа, ОШ) продуктов ПОЛ, которое рассчитывали по отношению Е232/Е220 (ДК), Е278/Е220 (СТ), Е400/Е220 (ОШ); результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.). Продукты ПОЛ опреде- ляли в гептановых и изопропанольных экстрактах, так как в гептан экстрагируются в основном нейтральные липиды, а в изопропанол — фосфолипиды, которые являются важнейшим субстратом ПОЛ [7]. Состояние антиоксидантной защиты оценивали по содержанию церулоплазмина в ротовой жидкости [5]. Во втором образце оценивали параметры люминолзависимой хемилюминесценции. Оценку ЛЗХЛ проводили по методу Ю.А. Владимирова [12], в нашей модификации [4]. Оценивали способность биологического материала (ротовой жидкости) подавлять ЛЗХЛ радикалообразующей смеси [5, 6, 8]. Смесь состояла из 1 мл трис-буфера (рН 8,8); 0,1 мл 25 ммоль/л раствора сернокислого закисного железа; 0,1 мл 0,1% раствора люминола и 0,1 мл ротовой жидкости — опыт. Контроль состоял из тех же ингредиентов, но вместо биоматериала использовали физиологический раствор; контроль ставили каждый день, пробы дублировали. Непосредственно перед измерением в обе кюветы (опыт и контроль) вносили по 0,1 мл свежеприготовленного 3% раствора перекиси водорода, затем в течение 5 мин осуществляли регистрацию результатов ЛЗХЛ на флуориметре/спектрофотометре Cary Eclipse FL1002M003 (Variant, США). Прибор автоматически регистрирует следующие параметры ЛЗХЛ: максимальную интенсивность свечения (Imax); площадь под кривой хемилюминесценции

(светосумма, S); время достижения максимума свечения (t). Результаты исследования представляли как степень подавления значений Imax и S при добавлении биологического материала относительно контроля (в процентах, %), за исключением кинетического параметра — времени достижения пика ЛЗХЛ (t).

Для расчета отклонений параметров исследуемой пробы от соответствующих значений контроля использовали формулу:

(ЛЗХЛк - ЛЗХЛо) / ЛЗХЛК) х 100%, где ЛЗХЛк — показатель ХЛ (раздельно для Imax и S) радикалообразующей смеси в присутствии физиологического раствора (контроль); ЛЗХЛо — показатель ХЛ (раздельно для Imax и S) радикалообразующей смеси в присутствии исследуемого материала (опыт).

Такой подход позволяет нивелировать колебания значений ЛЗХЛ, связанные с использованием реагентов разных фирм, а также сопоставлять результаты, полученные в различных лабораториях и с использованием различного биологического материала.

Этическая экспертиза

От всех обследованных лиц получено информированное согласие на участие в исследовании на основании этических норм Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Рекомендации для врачей, занимающихся биомедицинскими исследованиями с участием людей».

Статистический анализ

Статистическая обработка результатов проводилась с применением пакета прикладных программ Statistica версия 6.1 (StatSoft, США), с использованием непараметрических методов ввиду отсутствия согласия данных с нормальным распределением. Для оптимального представления о центральной тенденции, ширине и асимметрии показателей результаты выражали в виде Me (25%; 75%), где Me — медиана, 25% — нижний квартиль, 75% — верхний квартиль. С помощью рангового критерия U Манна–Уитни оценивали достоверность различий независимых групп. Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Критический уровень нулевой гипотезы принимали при р ≤0,05.

<линическая 2021 п эакти keu Том 12 №2

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследовании приняли участие 64 практически здоровых человека (26 мужчин и 38 женщин в возрасте от 18 до 43 лет) и 85 пациентов с РИВДП (37 мужчин и 48 женщин в возрасте от 18 до 49 лет). Различий по половозрастным показателям между контрольной группой и группой пациентов не выявлено.

Для определения интенсивности процессов свободнорадикального окисления РЖ мы использовали биологический материал, который хранился не более 2 ч после получения (табл. 1).

Как видно из табл. 1, у пациентов с РИВДП содержание продуктов окисления нейтральных липидов РЖ было выше, чем у здоровых лиц (ДК р=0,032 и ОШ р <0,001). Уровень вторичных продуктов окисления нейтральных липидов (СТ) РЖ у пациентов с РИВДП не изменялся в сравнении с содержанием СТ РЖ здоровых лиц (р >0,05). Окисление фосфолипидов РЖ у пациентов с респираторными инфекциями было интенсивнее, чем у здоровых лиц, о чем свидетельствует накопление всех продуктов окисления фосфолипидов (ДК р=0,024, СТ р=0,007 и ОШ р <0,001). Уровень церулоплазмина в РЖ у пациентов с РИВДП был выше, чем в группе сравнения р <0,001. Выявленные изменения параметров ПОЛ/АОЗ ротовой жидкости пациентов с РИВДП свидетельствуют об активации процессов свободнорадикального окисления и развитии легкой степени недостаточности АОЗ.

Во втором образце РЖ мы оценивали активность процессов свободнорадикального окисления методом ЛЗХЛ, при этом максимальная интенсивность свечения (Imax) рассматривалась как устойчивость равновесия между оксидантами и антиоксидантами в исследуемом материале, светосумма ХЛ (площадь под кривой, S) — как показатель общей емкости (мощности) антиоксидантной защиты (АОЗ), а также время достижения пика хемилюминесценции (t) — кинетический параметр, позволяющий судить об исходной антирадикальной активности биоматериала. Для формирования диапазона референтных значений мы определили границы колебаний параметров ЛЗХЛ в РЖ здоровых лиц с целью иметь возможность в дальнейшем определять, являются ли обнаруженные при разных патологических процессах изменения состоянием баланса или дисбаланса процессов свободнорадикального окисления методом ЛЗХЛ (табл. 2).

Как видно из табл. 2, у здоровых лиц показатели ЛЗХЛ ротовой жидкости колебались

Таблица 1 / Table 1

Содержание продуктов ПОЛ/АОЗ в ротовой жидкости обследованных лиц / Concentrations of pro- and anti-oxidant components in oral fluid of examined persons

Показатель, ед. измерения	Здоровые лица, n =64 (Ме 25; 75%)	Пациенты с РИВДП, n =85 (Ме 25; 75%)
Содержание продуктов липопероксидации нейтральных липидов
ДК, е.и.о.	0,629 (0,592; 0,686)	0,681 (0,596; 0,833)*
СТ, е.и.о	0,368 (0,337; 0,443)	0,356 (0,326; 0,400)
ОШ, е.и.о.	0,012 (0,008; 0,021)	0,038 (0,024; 0,079)*
Содержание продуктов липопероксидации фосфолипидов
ДК, е.и.о.	0,652 (0,616; 0,732)	0,664 (0,613; 0,901)*
СТ, е.и.о.	0,421 (0,402; 0,479)	0,537 (0,473; 0,614)*
ОШ, е.и.о.	0,022 (0,016; 0,034)	0,050 (0,032; 0,120)*
Параметры АОЗ
ЦП, мг/л	418,3 (409,5; 438,4)	760,2 (642,5; 984,1)*

Примечание. * Различия статистически значимы в сравнении со здоровыми лицами, р ≤0,05. Продукты окисления липидов: ДК — диеновые конъюгаты, СТ — сопряженные триены, ОШ — основания Шиффа, ЦП — церулоплазмин; ПОЛ/АОЗ — перекисное окисление липидов/антиоксидантная защита; РИВДП — рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей; е.и.о. — единицы индекса окисления.

Note. * The differences are statistically significant as compared to the healthy persons, р ≤0,05. The products of lipid oxidation: ДК — diene conjugates, СТ — conjugated trienes, ОШ — Schiff bases, ЦП — ceruloplasmin; ПОЛ/АОЗ — lipid peroxidation/antioxidant protection; РИВДП — recurrent upper respiratory tract infections; е.и.о. — units of the oxidation index.

Показатели люминолзависимой хемилюминесценции ротовой жидкости в обследуемых группах /

Levels of oral fluid LDCL of in the studied groups

Таблица 2 / Table 2

Показатель, ед. измерения	Здоровые лица, n =64			Пациенты с РИВДП в период ремиссии, n =85
	Ме	25–75%	5–95%	Ме	25–75%	5–95%
Imax, %	79,7	74,9–87,9	60,8–93,1	64,7*	58,2–67,6	47,9–85,4
S, %	71,7	62,3–76,5	54,3–87,4	60,4*	51,2–67,7	26,5–78,6
t, мин	0,72	0,60–0,87	0,39–1,12	0,95*	0,79–2,1	0,34–2,6

Примечание. * Различия статистически значимы в сравнении со здоровыми лицами, р ≤0,05. Ме — медиана; 25–75% — интерквартильный размах; 5–95% — интервал, включающий размах от 5-го до 95-го процентиля. РИВДП — рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей.

Note. * The differences are statistically significant as compared to the healthy persons, р ≤0,05. Ме — median; 25–75% — interquartile range; 5–95% — 5 to 95 procentile range. РИВДП — recurrent upper respiratory tract infections.

в широком диапазоне, что особенно видно при анализе 5–95-го процентильного интервала. У пациентов с РИВДП в период ремиссии, так же как и у здоровых лиц, наблюдается большой разброс по результатам ЛЗХЛ в РЖ. Однако имелись пациенты, у которых уровни Imax и S были ниже ( р <0,001), а уровень исходной антирадикальной активности выше ( р =0,018), чем у здоровых лиц. Параметры исходной антирадикальной активности (t) РЖ пациентов значительно варьировали, при этом у 56 пациентов они соответствовали интерквартильному диапазону (25–75%) референтных значений, а у 29 пациентов были значительно снижены. Возможно, это обусловлено накоплением антиоксидантов в очаге воспаления в ответ на повышение синтеза прооксидантов.

Основные результаты исследования

При анализе взаимосвязей различных параметров ЛЗХЛ в РЖ пациентов выявлено наличие значимых ассоциаций между S и t (r_s=-0,40; p =0,039) и уровнем церулоплазмина РЖ и t (r_s=0,23, p =0,034). Так как показатель t отражает исходную антира-дикальную активность, а церулоплазмин является одним из основных внеклеточных антиоксидантов, то выявленные корреляции вполне ожидаемы. Церулоплазмин, проникая через гематосаливарный барьер, может оказывать антирадикальный эффект в очаге инфекции, что приводит к удлинению латентного периода ЛЗХЛ (t) в РЖ.

Проведенные исследования продемонстрировали, что у большинства пациентов с РИВДП в период ремиссии отдельные составляющие прооксидантов (диеновые конъюгаты, основания Шиффа нейтральных липидов; сопряженные триены, основания Шиффа фосфолипидов ротовой жидкости), а также уровень антиоксиданта (церулоплазмина) РЖ были повышены в сравнении с контрольной группой. При этом параметры ЛЗХЛ ротовой жидкости не выходили за пределы референсного интервала, хотя и были изменены относительно медианы контрольной группы. Это позволяет рассматривать наблюдаемые колебания как баланс про- и антиоксидантов. Время достижения пика ХЛ (t) в РЖ пациентов с РИВДП позволяет дополнительно охарактеризовать изменения в системе ПОЛ/АОЗ, т.е. способность биологического материала сдерживать свободнорадикальные процессы. Кроме того, выявленные изменения в РЖ позволяют использовать ее в качестве альтернативного биоматериала для оценки про-/антиоксидантного баланса у пациентов с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексная оценка состояния про-/антиок-сидантной системы по параметрам ЛЗХЛ (Imax, S и t) позволяет оценивать как содержание антиоксидантов в биологическом материале на момент исследования, так и резервные возможности системы в целом. Такая оценка может быть использована для интегральной характеристики резервных возможностей организма.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Т.С. Петренко — анализ литературы, сбор клинического материала и лабораторные исследования биологических образцов

<линическая 2021 п эакти keu Том 12 №2

пациентов, написание статьи; И.А. Новикова — лечение пациентов, обсуждение результатов исследования, написание текста статьи; В.М. Девичен-ский прочел и одобрил направление рукописи на публикацию (разделил ответственность за изложенные данные с коллективом авторов), О.В. Денисова — экспертиза лабораторной части статьи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).