Анализ ассоциации эпсилон полиморфизма гена аполипопротеина Е с риском развития рассеянного склероза

Рассеянный склероз (РС) – хроническое демиелинизирующее заболевание с множественными очагами поражения преимущественно в центральной нервной системе, протекающее с гетерогенной клинической 76

картиной и непредсказуемым течением. Поражая лиц молодого возраста, болезнь почти неизбежно приводит к необратимым неврологическим нарушениям, а в последующем к стойкой инвалидизации. Клиническая диагностика РС нередко представляет большие трудности, особенно при дебюте заболевания [3, 4, 8]. Несмотря на разработанные различные варианты клинических шкал и совершенствующиеся методы нейровизуализации и иммунологической диагностики [2, 7], иногда к моменту постановки диагноза проходит значительный срок. Проблема ранней диагностики и целенаправленного лечения этих больных представляет большую практическую и социальную значимость.

Географическое распространение РС уникально среди заболеваний нервной системы. В результате многочисленных эпидемиологических исследований было выявлено, что существенное влияние на риск развития заболевания оказывает место проживания или принадлежность к определенной этнической группе. Наиболее высокая распространенность РС отмечена среди европеоидов – выходцев из Центральной и Северной Европы, Скандинавии. В последние годы в связи с интенсивным развитием молекулярно-генетических механизмов мультифакториальных заболеваний (МФЗ) особое внимание уделяется поиску «генов предрасположенности», которые совместимы с рождением и жизнью в постнатальном периоде, но при определенных неблагоприятных условиях способствуют развитию того или иного заболевания. [1]. Общепринятым подходом к изучению вклада наследственной компоненты в проявлении МФЗ является поиск ассоциации аллельных вариантов исследуемых генов с определенным заболеванием с использованием метода «случай–контроль». В настоящий момент известно более 150 «генов предрасположенности» РС.

Аполипопротеин Е (AроE) (OMIM 107741) – гликопротеид, состоящий из 299 аминокислотных остатков, является важнейшим компонентом, имеющим большое значение для нормального метаболизма в центральной нервной системе, процессах формирования и регенерации нервной ткани [9, 11]. Ген APOE находится на 19-й хромосоме (19q13.2) и состоит из 4 экзонов и 3 интронов общей протяженностью 36000 п.о. Данный ген представлен тремя аллелями ( ε 2, ε 3, ε 4), которые соответствуют изоформам белков Аро Е2, Е3 и Е4, различающихся разными комбинациями аргинина и цистеина в позициях 112 и 158. В результате замен аминокислот возникают характерные физические и биохимические нарушения. Аллель ε 4 встречается в общей популяции с частотой 10-23%. Установлено, что он ассоциирован с риском развития и когнитивными нарушениями при болезни Альцгеймера, сердечно-сосудистыми заболеваниями. Некоторые авторы установили ассоциацию аллеля ε 4 гена АРОЕ с возрастом начала заболевания, скоростью прогрессирования, женским полом больных, типами течения РС [11, 12].

Целью исследования явился анализ ассоциаций эпсилон-полиморфизма гена АРОЕ с риском развития рассеянного склероза у русских и якутов, проживающих на территории Республики Саха (Якутия).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Характеристика исследованных групп. Обследован 61 больной с достоверным диагнозом рассеянный склероз в соответствии с критериями Мак-Дональда [4] и не родственные здоровые лица, отобранные на основании сходства с больными по признакам возраста, пола и национальности (262 чел.). Для участия в исследовании у всех пациентов и у здорового контроля было получено информированное согласие. Исследование было одобрено этическим комитетом ЯНЦ СО РАМН. Средний возраст больных в общей группе составил 38,39±1,41 года. Всех больных РС разделили на две группы по этнической принадлежности. Первая группа включала русских – 47 человек (31 женщина, 16 мужчин), средний возраст – 39,9±1,8 года. Возраст к началу заболевания – 29,11±1,46 года, продолжительность болезни к моменту исследования – 10,61±2.59 года, длительность первой ремиссии – 2,32±0,42. Степень инвалидизации по шкале Куртцке (EDSS) соответствовала 3,9±0,23 балла. Коэффициент прогрессирования (КП) (балл

Таблица 1

Частоты аллелей и частоты генотипов эпсилон-полиморфизма у больных-русских РС и в группе здорового контроля

Аллели и генотипы	Больные РС (п=47)	Здоровые русские (n=131)	Значение p при сравнении частот
аллели n(%)
е2	5 (5,3)	27 (10,3)	нд
еЗ	75 (79,8)	204 (77,8)	нд
е4	14( 14,9)	31 (11,8)	нд
генотипы n(%)
е2/е2	-	3 (2,3)	нд
е2/еЗ	4 (8,5)	19 (14,5)	нд
е2/е4	1 (2,1)	2 (1,5)	нд
еЗ/еЗ	29 (61,7)	79 (60,3)	нд
еЗ/е4	13( 27,6)	27 (20,6)	нд
е4/е4	-	1 (0,7)	нд

Примечание: нд – не обнаружено статистически значимых различий.

Таблица 2

Частоты аллелей и частоты генотипов эпсилон-полиморфизма у больных-якутов РС и в группе здорового контроля

Аллели и генотипы	Больные РС (п=14)	Здоровые якуты (n=131)	Значение p при сравнении частот
аллели n(%)
е2	-	24 (9,16)
еЗ	23 (82,14)	209 (79,7)	нд
е4	5 (17,86)	29 (11,06)	нд
генотипы n(%)
е2/е2	-	1 (0,76)	нд
е2/еЗ	-	21 (16,0)	нд
е2/е4	-	1 (0,76)
еЗ/еЗ	9 (64,28)	82 (62,59)	нд
еЗ/е4	5 (35,72)	24 (18,32)	нд
е4/е4	-	2 (1,52)

Примечание: нд – не обнаружено статистически значимых различий.

EDSS/продолжительность болезни, годы) составил 0,59±0,07. Во вторую группу вошли якуты – 14 человек (11 женщин и трое мужчин), средний возраст – 33,93±2,18. Возраст начала заболевания – 23,5±2,09 года, длительность болезни к моменту исследования – 9,0±1,81 года, длительность первой ремиссии – 3,46±1,07. Балл по EDSS составил 3,78±0,34 балла, КП – 0,71±0,13.

Таблица 3

Клиническая характеристика русских больных с рассеянным склерозом (n=47) в зависимости от наличия (+) или отсутствия (-) аллеля е4

Показатель	ε4 (–)АРОЕ	ε4 (+)АРОЕ
Количество больных РС	33	14
Возраст, годы (mean±S.E.)	42,39±1,82	33,36±3,04
Возраст к началу заболевания, годы (mean±S.E.)	31,42±1,38	24,21±2,97
Женщины/мужчины	21/12	10/4
Женщины,%	63,63%	71,43%
Продолжительность болезни, годы (mean±S.E.)	10,65±1,22	9,21±1,67
Балл по EDSS (mean±S.E.)	3,9±0,27	3,42±0,28
Длительность первой ремиссии, годы (mean±S.E.)	2,11±0,39	2,53±0,44
Коэффициент прогрессирования, (mean±S.E.)	0,65±0,10	0,47±0,06

Примечание: mean±S.E. – среднее арифметическое значение со стандартной ошибкой.

и аллелей в общей группе больных РС русских и в контрольной группе русских статистически значимых различий не выявлено. Но можно отметить, что частота генотипа ε 3/ ε 4 выше в группе больных по сравнению с контролем 27,6% и 20,6% соответственно. Также патогенетически значимая частота аллеля ε 4 в группе больных РС была незначительно выше (14,9%), чем в контрольной группе (11,8%), но это различие не достигло статистически значимого значения.

До середины 80-х годов прошлого столетия в работах, посвященных эпидемиологии рассеянного склероза, не упоминались случаи РС среди коренных жителей Якутии (якутов, эвенков, эвенов, юкагиров) [6]. В последующих публикациях отмечались зарегистрированные единичные случаи рассеянного склероза у якутов [5]. В настоящее время, используя методы магнитно-резонансной томографии, можно провести более все-стороннее и углубленное ис

В качестве контрольной группы использовали соответственно две популяционные выборки. Первую группу также составили русские – 131 человек (средний возраст – 36,24±0,95). Вторая группа включала 131 якута (средний возраст – 38,12±0,92). Все исследованные контрольные группы не имеют по результатам клинического и параклинического обследования неврологической патологии.

ДНК выделяли из венозной крови больных методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование по полиморфному варианту Arg158Cys, Cys112Arg гена АРОЕ проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанные в литературе [10]. Амплификат подвергали гидролизу рестриктазой HhaI («Фермен-тас», Германия).

Для сравнения частот генотипов и аллелей с РС использовали критерий χ ² Пирсона с поправкой Йетса. Использовали также двухсторонний точный тест Фишера, в случае если ожидаемое значение хотя бы в одной ячейке таблицы сопряженности было меньше 5. Статистически значимыми считались различия при значениях достигнутого уровня значимости p ниже критического: р <0,05 .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты генотипирования по полиморфному варианту Arg158Cys, Cys112Arg гена АРОЕ у больных РС и контрольной группы представлены в таблице 1 у русских и в таблице 2 у якутов. Из них видно, что в изученных группах преобладают генотипы ε 3/ ε 3 и ε 3/ ε 4, а также аллель ε 3, что соответствует литературным данным [12]. При сравнении частот генотипов 78

следование больных. Так, в настоящее исследование включены больные якуты с достоверным диагнозом РС, подтвержденным данными МРТ головного и спинного мозга. При генотипировании по эпсилон-полиморфизму гена АРОЕ у 9 больных РС выявлен генотип ε 3/ ε 3, у пятерых генотип ε 3/ ε 4 (табл. 2). В данной группе больных преобладает аллель ε 3 (82,1%), как и в контрольной группе (79,7%). При их сравнении выявлено повышение частоты генотипа ε 3/ ε 4 в группе больных РС, чем в контрольной группе здоровых якутов (35,7 и 18,7% соответственно).

При сравнении здоровых якутов и русских статистически значимых различий не выявлено, в этих группах частота аллеля ε 4 не отличается от таковой в популяциях поляков, итальянцев, французов, американцев [12].

В нашем исследовании мы сравнивали клинические характеристики групп больных РС русских позитивных и негативных по аллелю ε 4. Результаты исследования представлены в таблице 3. Выявлено более раннее начало заболевания в группе ε 4-пози-тивных больных РС (24,21±2,97), чем в группе ε 4-негативных больных РС (31,42±1,38). Кроме того, установлено, что в группе ε 4-позитивных больных РС больше женщин (71,43%), чем в группе ε 4-негативных больных РС (63,63%).

Ассоциацию аллеля ε 4-гена АРОЕ с КП заболевания установили несколько авторов [12]. При сравнении ε 4-негативных и ε 4-позитивных больных РС выявлено увеличение КП у ε 4-негативных больных (0,65±0,10 против 0,47±0,06). После разделения больных по этническому признаку во второй группе, то есть у якутов, КП оказался выше и составил 0,71±0,13 у ε 4-негативных больных.

ВЫВОДЫ

Таким образом, при межпопуляционном сравнении контрольных групп русских и якутов не выявлено статистически значимых различий по эпсилон-полиморфизму гена АРОЕ. Установлено, что в группе больных рассеянным склерозом более высокая частота гетерозигот по эпсилон-полиморфизму. У русских женщин, носителей аллеля ε 4 гена АРОЕ, риск раннего развития РС несколько выше, чем в общей популяции русских в Якутии. Скорость прогрессирования заболевания в группе ε 4-негативных больных выше, чем в группе ε 4-позитивных больных рассеянным склерозом. Эти различия наиболее четко прослеживаются у якутов. Возможно, АРОE может иметь значение как для развития рассеянного склероза, так и для последующего его течения, а анализ его аллельного полиморфизма имеет прогностическую ценность.