Анализ частоты TCR-мутантных лимфоцитов у больных колоректальным раком до лечения

Поиск эффективных биомаркеров канцерогенного риска продолжает оставаться актуальной проблемой онкологии на протяжении многих лет. В последнее время значимость этой проблемы не только не уменьшается, но всё больше возрастает в связи с увеличением онкологической заболеваемости во всём мире. Основой для решения этой проблемы являются фундаментальные знания о закономерностях и механизмах канцерогенеза, в том числе ключевого процесса в ходе злокачественной трансформации клеток – соматического мутагенеза. В частности, принято считать, что колоректальный канцерогенез связан с двумя формами нестабильности генома – хромосомной и микросателлитной [12, 16].

Фенотип хромосомной нестабильности, обнаруживаемый в 85% злокачественных новообразований различных отделов толстой кишки, характеризуется анэуплоидией и множественными хромосомными перестройками. Фенотип микросателлитной нестабильности найден примерно в 15% злокачественных новообразований. Он связан с небольшими по размеру, но многочисленными инсерциями и делециями, главным образом, в повторяющихся последовательностях нуклеотидов, при этом опухолевые клетки остаются диплоидными, но имеют множество генных мутаций. Часть опухолей с микросателлитной нестабильностью содержит наследственные мутации в генах репарации не спаренных оснований (синдром Линча), что и является причиной такой нестабильности. У части больных причиной микросателлитной нестабильности является гиперметилирование промоторов соответствующих генов репарации (в основном MLH1 ). Только небольшая часть (около 1%) всех колоректальных раков имеет признаки нестабильности генома обоих типов одновременно.

Орлова Н . В .* – ст . научн . сотр ., к . б . н .; Смирнова С . Г . – ст . научн . сотр ., к . б . н .; Рухадзе Г . О . – научн . сотр .; Ерыгин Д . В . – ст . научн . сотр ., к . м . н .; Бердов Б . А . – зам . директора по научн . работе , д . м . н ., профессор ; Лозебной Н . И . – аспирант ; Замулаева И . А . – зав . лаб ., д . б . н ., профессор . ФГБУ МРНЦ Минздрава России .

Как было показано в 90-е годы прошлого века, мутагенез нормальных соматических клеток (лимфоцитов периферической крови) больных колоректальным раком характеризуется высокой частотой структурных мутаций (хромосомных аберраций) по сравнению с таковой у здоровых лиц [11, 19]. Кроме того, лимфоциты больных обладают более высокой чувствительностью к разнообразным повреждающим агентам, чем лимфоциты здоровых лиц [9, 19]. Поэтому было сделано предположение о возможности использования частоты структурных мутаций в лимфоцитах в качестве биомаркера канцерогенного риска. Это предположение в дальнейшем было подтверждено в результате проспективных исследований онкологической заболеваемости, включая рак желудочно-кишечного тракта, у лиц с разной частотой структурных мутаций [17].

В то же время в отдельном исследовании соматического мутагенеза у больных колоректальным раком с микросателлитной нестабильностью было установлено отсутствие различий частоты структурных мутаций в лимфоцитах больных и здоровых лиц [14], что неудивительно, учитывая механизмы формирования таких мутаций. Скорее можно предположить, что у таких больных повышается частота генных, а не структурных мутаций, однако ни в этой работе, ни позднее такого анализа не проводилось. Более того, частота генных мутаций в лимфоцитах общей группы больных колоректальным раком также практически не исследована, хотя такая информация представляет несомненный интерес с точки зрения разработки биомаркеров канцерогенного риска. Поэтому целью данной работы является сравнительный анализ частоты генных соматических мутаций в лимфоцитах больных колоректальным раком до лечения и здоровых лиц. Для исследования были выбраны гены Т-клеточного рецептора (T-cell receptor – TCR), которые содержат микросателлитные последовательности, в том числе в кодирующих участках. Кроме того, частота TCR-мутаций является маркером генотоксического действия различных факторов [5, 18] спонтанной [6] и индуцированной [3] генетической нестабильности соматических клеток.

Материалы и методы

Частота TCR-мутантных лимфоцитов была определена у больных раком различных отделов толстой кишки до лечения. Больные находились на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области ФГБУ МРНЦ Минздрава России. Было обследовано 55 человек (26 мужчин и 29 женщин) в возрасте от 47 до 88 лет (в среднем 63 года). У 3-х больных установлена I стадия заболевания, у 12-ти – II, у 22-х – III, у 18-ти – IV. 28 пациентов имели диагноз рак прямой кишки, 27 пациентов – рак различных отделов ободочной кишки.

Определение частоты TCR-мутантных клеток проводили по методике, разработанной в начале 90-х годов прошлого века японскими авторами [13] и усовершенствованной нами с целью повышения точности метода [5]. Для идентификации мутантных клеток использовали моноклональные антитела, меченные разными флуорохромами, к CD3, CD4 и HLA-DR (Becton Dickinson Immunocytometry Systems – BDIS, США).

Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (BDIS, США). Компьютерную обработку проводили с использованием программы CellQuestPro (BDIS, США). Частоту мутантных клеток определяли как отношение числа клеток с фенотипом CD4+CD3-HLA-DR-к числу CD4+CD3+ клеток.

В связи с тем, что частота соматических клеток с мутациями увеличивается с возрастом даже в случае отсутствия генотоксических воздействий, обусловленных неблагоприятными условиями проживания, профессиональным контактом с вредными воздействиями различной природы или другими причинами, в работе выполнен расчёт возрастной нормы частоты TCR-мутантных клеток. Нормальный диапазон частоты TCR-мутантных клеток соответствовал 95%-ному доверительному интервалу, установленному для 455 контрольных здоровых лиц (в возрасте от 14 до 77 лет) с учётом возрастной зависимости, как показано на рис. 1.

Возраст, лет

Рис . 1. Зависимость частоты TCR-мутантных клеток от возраста в группе контрольных лиц. Пунктирные линии показывают границы 95%-ного доверительного интервала для частоты мутантных клеток.

Для группового сравнения частот мутантных клеток у онкологических больных и контрольных лиц из вышеупомянутой базы данных была выбрана контрольная группа сходного возраста (n=73).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США) для персонального компьютера. Значимость различий частоты мутантных клеток в двух выборках оценивали по критерию Манна-Уитни. Сравнение доли лиц с повышенными частотами мутантных клеток в двух группах проводили с помощью критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

На рис. 2 представлены гистограммы распределения частоты мутантных клеток у обследованных нами онкологических больных и контрольных лиц сходного возраста. Характер распределения частоты мутантных клеток в группе онкологических больных не соответствовал нормальному (р<0,05 по критерию Shapiro-Wilk’s W test). Исходя из этого, использовали непараметрические методы статистической обработки данных. У больных колоректальным раком до лечения частоты TCR-мутантных клеток находились в интервале от 0,8х10^-4 до 30,8х10^-4. Медиана составляла 5,3х10^-4, квартили - (3,7-7,6)х10^-4. Не было обнаружено статистически значимых различий частоты мутантных клеток у мужчин (n=26) и женщин (n=29): 5,5х10 " ⁴ vs 5,3х10 " ⁴, соответственно (p=0,9).

В группе контрольных лиц частота мутантных клеток варьировала от (1,2 до 8,7)х10-4. Медиана составляла 4,0х10-4, квартили - (3,3-6,4)х10-4.

Частота TCR-мутантных клеток, х10 -4                      Частота TCR-мутантных клеток, х10 -4

Рис . 2. Гистограмма распределения частоты TCR-мутантных клеток у больных раком толстой кишки до лечения и контрольных здоровых лиц сходного возраста.

По критерию Манна-Уитни частота мутантных клеток у больных до лечения была статистически значимо выше таковой у контрольных лиц (p=0,02).

У 24% онкологических больных частота мутантных клеток превышала возрастную норму (95%-ный доверительный интервал, установленный для контрольных лиц с учётом возрастной зависимости). Повышенная частота мутантных клеток встречалась статистически значимо чаще в группе больных, чем здоровых лиц сходного возраста (p=0,003). Сходные результаты были получены ранее нами и другими авторами в отношении генных соматических мутаций у онкологических больных с опухолями различных локализаций до лечения [1, 2, 4, 7, 10]. Однако до сих пор были известны лишь единичные данные о частоте генных мутаций в лимфоцитах больных колоректальным раком, полученные к тому же на ограниченной выборке больных [20].

Чтобы выяснить, имеется ли какая-либо связь частоты мутантных клеток со стадией заболевания по системе TNM и локализацией первичного очага все больные были разделены на несколько групп. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют об отсутствии значимых различий между выделенными группами как по частоте TCR-мутантных клеток, так и по доле лиц с повышенной частотой таких клеток.

Таблица 1

Частота TCR- мутантных клеток в разных группах онкологических больных

Группы лиц	Число лиц	Частота TCR-мутантных клеток, х10-4		Доля лиц с повышенными частотами, %
		медиана	квартили
Контроль	73	4,0	3,3-6,4	5,0
Колоректальный рак (все больные)	55	5,3	3,7-7,6	24,0
Т1-Т2	15	5,8	4,2-7,8	26,7
Т3	22	4,4	3,2-7,0	22,7
Т4	18	6,0	4,3-7,6	22,2
N0M0	25	5,7	3,1-6,6	20,0
N+M0	15	5,0	3,6-7,0	20,0
N+M+	13	5,1	4,0-9,0	31,0
Рак прямой кишки	28	5,6	3,7-7,5	25,0
Рак ободочной кишки	27	4,7	3,5-6,5	22,0

Примечание: анализ данных в группе больных на стадии N0M+ не проводился из-за её малочисленности (n=2).

Одно из возможных объяснений повышенной частоты мутантных клеток у онкологических больных до лечения заключается в действии генотоксического фактора (-ов) на организм таких лиц в прошлом. Другая причина может быть связана с наличием у части больных нестабильности генома соматических клеток, обусловленной наследственными или какими-либо иными факторами. Возможно также, что в ответ на наличие опухолевых клеток происходит Т-клеточная активация, приводящая к увеличению частоты мутаций [8]. Наконец, нельзя исключить влияние самого опухолевого процесса (как источника окислительного стресса) на возникновение и элиминацию мутаций. Однако следует отметить, что наши данные об отсутствии увеличения частоты TCR - мутантных лимфоцитов у больных на поздних стадиях заболевания свидетельствуют против последнего предположения, которое довольно активно обсуждается в литературе. Так, в нашем исследовании не установлено различий в частоте мутантных лимфоцитов в группе больных без поражения регионарных лимфатических узлов и отдалённых метастазов (N0M0) по сравнению с остальными больными: 5,7 vs 5,1 (p=0,67) соответственно. Хотя, в литературе имеются данные о том, что опухоли с микросателлитной нестабильностью выявляются на более ранних стадиях опухолевого процесса и меньше метастазируют, чем опухоли с хромосомной нестабильностью [15].

Таким образом, в работе показано статистически значимое увеличение частоты TCR-мутантных лимфоцитов у части больных колоректальным раком до лечения по сравнению с таковой у здоровых лиц. Это свидетельствует о возможности применения данного показателя соматического мутагенеза для оценки риска возникновения колоректального рака, однако необходимы дальнейшие исследования для получения прямых доказательств проспективного характера, причём отдельно для опухолей с разными типами нестабильности генома.