Анализ генетического разнообразия Larix sibirica Ledeb. и Pinus sylvestris L., перспективных в качестве источников биологически активных веществ растительного происхождения

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 577.21:582.475.2                                

Новые открытия в области медицины постоянно увеличивают потребность человечества в новых лекарственных препаратах различной природы, в том числе растительного происхождения, отличающиеся относительно малой токсичностью, возможностью длительного приема, легкой усвояемостью, широким спектром терапевтического действия [1]. Растения являются источником большого числа разнообразных биологически активных веществ (БАВ), таких как витамины, алкалоиды, гликозиды, дубильные вещества, полисахариды, флавоноиды, смолы, органические кислоты, фитонциды и другие. Получение различных БАВ из видов хвойных растений является экономически перспективным, поскольку древесные хвойные растения широко распространены, запас хвойных пород в России составляет около 71,3 млрд м3 . Важным аргументом в пользу получения БАВ из хвойных пород деревьев также является экологичность такого решения, поскольку в процессе лесозаготовки образуется много неиспользуемых отходов.

Одним из перспективных источников БАВ являются смоляные кислоты. Наиболее перспективной является абиетиновая кислота, так как она обладает противомикробной, противовоспалительной, противосудорожной активностями и ускоряет заживление ран [2–5]. Кроме этого, абиетиновая кислота способна подавлять рост клеток не мелкоклеточного рака легкого путем блокирования передачи сигналов IKKβ/NF-κB [6]; а также может использоваться при лечении аллергических реакций, ингибируя 5-липоксигеназу [7].

Роль генетического разнообразия в синтезе смоляных кислот у сосны обыкновенной и лиственницы сибирской, обладающих абиетиновой кислотой с противомикробной активностью, на популяционном уровне в Пермском крае ранее не изучалась.

Материал и методы исследования

Проанализировано 15 образцов смолы сосны обыкновенной и 15 образцов смолы лиственницы сибирской из различных мест произрастания Среднего Урала (Рисунок 1): из горной части Среднего Урала (гора Карабаш и Аракульский шихан), из равнинной части Среднего Урала (Очерский и Пермский районы Пермского края).

Содержание смоляных кислот определяли с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС). Смоляные кислоты подвергались дериватизации гидроксидом тетраметиламмония с целью перевода их в метиловые эфиры. Предварительно готовили растворитель с внутренним стандартом — метанол, содержащий 2 мг/мл дифенила, путем растворения навески дифенила 100 мг в мерной колбе на 50 мл в метаноле.

Рисунок 1. Карта-схема расположения мест сбора образцов лиственницы сибирской и сосны обыкновенной; синим цветом обозначены места сбора образцов сосны обыкновенной, красным — лиственницы сибирской; двумя цветами отмечены места сбора образцов обоих видов

Навеску (~50 мг) образцов точной массы помещали в пробирку типа Eppendorf, прибавляли 800 мкл растворителя, а затем 400 мкл раствора тетраметиламмоний гидроксида (25% водн.). Пробирку закрывали и помещали на 30 мин в ультразвуковую ванну до полного диспергирования образцов. Полученную суспензию центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Для хроматографического исследования использовали супернатант.

Анализ подготовленных образцов проводили на газовом хроматографе Agilent7890B с масс-спектрометрическим детектором 5977A MSD. Колонка — капиллярная HP-1MS, 30 м * 0,25 мм. Газ носитель — гелий, поток 1 мл/мин. Температура испарителя 300°С. Температурный градиент: 200 °С — 2 мин, 5 °С/мин — до 270 °С, 270 °С — 0,5 мин. Объем вводимой пробы — 0,05 мкл. Способ введения — c делением потока 25:1. Диапазон сканирования масс 16–800. В интервал времени 0–1,5 мин детектор отключали. Идентификация соединений осуществлялась по коммерческой библиотеке масс-спектров NIST.

Содержание абиетиновой кислоты определяли по калибровочному графику. Калибровочный график построен по данным, полученным при анализе 4 образцов чистой абиетиновой кислоты таким же методом. Калибровочные образцы подготовлены в аналогичных условиях, вместо навесок образцов вводили навески чистой абиетиновой кислоты.

Для выделения ДНК использовали СТАВ-метод [8], модифицированный добавлением в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). Навеска растительного материала составляла 20 мг. Концентрацию и спектральную характеристику ДНК определяли на приборе SpectrofotometrTMNanoDrop2000 (Thermo scientific, США). Для проведения ПЦР концентрацию ДНК каждой пробы выравнивали до 10 нг/мкл. Молекулярно-генетический анализ проведен с использованием ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) метода анализа полиморфизма ДНК [9] с использованием последовательностей 5 ISSR-праймеров

(Таблица 1), наиболее эффективных в геноме данного вида по результатам предыдущих исследований.

Таблица 1

ХАРАКТЕРИСТИКА ISSR-ПРАЙМЕРОВ

Праймер	Нуклеотидная последовательность, (5'→ 3')	Т отж, °С
Larix sibirica Ledeb.
CR-215	CTC-TCT-CTC-TCT-CTC-TTG	56
ISSR-8	GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-C	56
X10	AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-C	64
X11	AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-G	64
M3	ACA-CAC-ACA-CAC-ACA-CCT	54
Pinus sylvestris L.
ISSR-1	ACA-CAC-ACA-CAC-ACA-CT	56
CR-215	CTC-TCT-CTC-TCT-CTC-TTG	56
CR-212	CAC-ACA-CAC-ACA-GT	56
M27	GAG-AGA-GAG-AGA-GAG-AC	52
X10	AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-C	64

Примечание: Т отж — температура отжига праймера

Реакционная смесь объемом 25 мкл для полимеразной цепной реакции содержала: 2 единицы Tag -полимеразы; 2,5 мкл стандартного 10× буфера для ПЦР; 2,5 мМ MgCl 2 («Силекс М», Россия); 0,25 мM dNTP (Fermentas, Литва); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 5 мкл тотальной ДНК. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере GeneAmp PCRSystem 9700 (Applied Biosystems, США) по стандартной для ISSR-PCR метода программе: предварительная денатурация 94 °C, 2 мин; первые пять циклов 94 °С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72 °С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94 °С, 5 сек.; t° отж., 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72 °С. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в 1× ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации GelDoc XR (Bio-Rad, США). Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркер молекулярного веса (100 bp +1,5 + 3 Kb DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», Москва) и программу Quantity One (Bio-Rad, США).

Для проверки достоверности полученных результатов ПЦР и электрофорез повторяли не менее трех раз. Для количественной оценки генетического разнообразия данные молекулярно-генетического анализа были представлены в виде матрицы бинарных признаков. Компьютерный анализ полиморфизма ДНК корреляционный анализ поводили с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли ( Р 95 ) полиморфных локусов, абсолютного ( n a ) числа аллелей, эффективного ( n e ) числа аллелей, ожидаемой ( H E ) гетерозиготности [10]. Генетический анализ проводился с использованием специализированного макроса для MS Exel GenAlEx 6.

Результаты и обсуждение

В образцах смолы сосны обыкновенной были выявлены следующие вещества, в том числе обладающие биологической активностью: 1-фенантренкарбоновая кислота, 4a(2H)-фенантренкарбоновая кислота, 7-оксодегидроабиетиновая кислота, дегидроабиетиновая кислота, абиетиновая кислота, 7-метокси-1,4а-диметил-1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидрофенантрен-1-карбоновая кислота. В образцах смолы лиственницы сибирской были обнаружены 1-Нафталинпропанол, 1-фенантренкарбоновая кислота, дегидроабиетиновая кислота, абиетиновая кислота.

Количественный анализ проведен у абиетиновой и дегидроабиетиновой кислот, обладающих большим потенциалом использования их в качестве БАВ [2–6, 11]. Установлено, что в образцах смолы лиственницы сибирской абиетиновой кислоты содержится больше, чем в образцах сосны обыкновенной. Обратная ситуация с дегидроабиетиновой кислотой, которой больше в образцах сосны обыкновенной нежели в образцах лиственницы сибирской (Таблица 2).

Таблица 2 СОДЕРЖАНИЕ АБИЕТИНОВОЙ И ДЕГИДРОАБИЕТИКОВОЙ КИСЛОТ

В ИЗУЧАЕМЫХ ОБРАЗЦАХ Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb.

Образец (P. sylvestris)	w(abiet), %	w(deab), %	Образец (L. sibirica)	w(abiet), %	w(deab), %
PS-1	3,79	29,29	LS-1	29,86	1,50
PS-2	7,71	33,80	LS-2	7,71	7,97
PS-3	8,00	22,03	LS-3	5,43	8,19
PS-4	7,84	27,21	LS-4	5,07	7,20
PS-5	13,70	19,64	LS-5	7,32	5,52
PS-6	9,04	24,37	LS-6	20,28	3,61
PS-7	10,16	16,22	LS-7	14,81	3,55
PS-8	7,52	22,02	LS-8	9,19	4,44
PS-9	7,13	21,73	LS-9	13,66	3,43
PS-10	9,45	19,05	LS-10	23,66	2,99
PS-11	6,19	22,17	LS-11	14,76	3,13
PS-12	13,59	10,27	LS-12	19,48	3,12
PS-13	7,55	12,89	LS-13	12,46	5,10
PS-14	9,39	19,83	LS-14	12,30	4,14
PS-15	12,90	17,13	LS-15	21,31	4,12
Среднее	8,93	21,18	Среднее	14,49	4,54

Примечание: w(abiet) — содержание абиетиновой кислоты в %, w(deab) — содержание дегидроабиетиновой кислоты в %; подчеркнуты данные с наибольшим % кислот

Изучаемые образцы разбивались на группы в зависимости от содержания в них абиетиновой или дегидроабиетиновой кислот, от меньшего к большему. Для сосны обыкновенной было выделено 4 группы по содержанию абиетиновой кислоты (% от навески образца): I — от 3,78 до 6,19%; II — от 7,12 до 7,99%; III — от 9,04 до 10,16%; IV — от 12,89 до 13,69%. Кроме этого, установлены 4 группы по количественному содержанию дегидроабиетиновой кислоты: I — от 10,26 до 10,89%; II — от 16,21 до 17,12%; III — от 21,73 до 22,17%; IV — от 24,37 до 33,80%. Для лиственницы сибирской было выделено также 4 группы по содержанию абиетиновой кислоты: I — от 5,07 до 7,70%; II — от 9,18 до 13,65%; III — от 14,47 до 19,47%; IV — от 20,27 до 29,85%. Для лиственницы сибирской было установлено также 4 группы по содержанию дегидроабиетиновой кислоты: I — от 1,49 до 3,13%; II — от 3,43 до 4,14%; III — от 4,44 до 5,51%; IV — от 7,20 до 8,18%.

Содержание абиетиновой кислоты у P. sylvestris варьировало от 3,79% до 13,70% при этом максимальные значения отмечены у деревьев PS-5, PS-7, PS-12 и PS-15, в диапазоне от

• 10,16 % до 13,70%. Эти образцы из разных мест сбора, PS-5 и PS-15 — с Аракульського шихана, PS-7 — из Качканара, PS-12 — из Очерского района. Содержание дегидроабиетиновой кислоты у P. sylvestris варьировало от 10,26% до 33,80% (% от навески образца). При этом, максимальные значения отмечены у деревьев PS-1, PS-2, PS-4 и PS-6, в диапазоне от 24,37% до 33,80%. Эти образцы с деревьев PS-1, PS-2, PS-4, которые взяты с Аракульского шихана, а с дерева PS-6 — из Качканара.

Содержание абиетиновой кислоты у L. sibirica варьировало от 5,07% до 29,86%. Наибольшим содержанием абиетиновой кислоты характеризуются деревья LS-1, LS-6, LS-10, LS-15, у которых содержание этой кислоты изменялось от 21,31% до 29,86%. При этом, дерево LS-1 растет на Аракульском шихане, дерево LS-6 – в Пермском районе, деревья LS-10 и LS-15 – на Качканаре. Содержание дегидроабиетиновой кислоты у L. sibirica варьировало от 1,49% до 8,18%. Наибольшим содержанием дегидроабиетиновой кислоты характеризуются деревья LS-2, LS-3, у которых содержание этой кислоты изменялось от 7,97% до 8,18%. Оба образца собраны с деревьев, растущих в Пермском районе.

Итак, нам основе анализа имеющихся данных не выявлено зависимости содержания абиетиновой кислоты от места произрастания образцов. Определено преобладание в образцах смолы сосны обыкновенной фракции дегидроабиетиновой кислоты, а в образцах смолы лиственницы сибирской — абиетиновой кислоты, что характерно для этих видов и отмечено в других исследованиях [12, 13].

Таким образом, для сосны обыкновенной характерно преобладание дегидроабиетиновой, а для лиственницы сибирской — абиетиновой кислоты. Для молекулярно-генетического анализа перспективны образцы с наибольшим и наименьшим содержанием кислот для выявления генетических детерминант, определяющих количественное содержание кислот в смоле.

При молекулярно-генетическом анализе проб ДНК, выделенных из образцов сосны обыкновенной, с использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК, в ПЦР было амплифицировано 70 фрагментов ДНК. Используемые праймеры выявляли от 10 до 17, в среднем 14 фрагментов ДНК. Длины фрагментов ДНК варьировали от 230 до 1500 пар нуклеотидов. Доля полиморфных локусов ( P 95 ) была равна 0,914. Абсолютное число аллелей ( n a ) для сосны обыкновенной составило 1, 914, а эффективное число аллелей ( n е ) — 1,356. Ожидаемая гетерозиготность ( He ) составляла 0,230, а информационный индекс Шеннона ( I ) — 0,369.

При анализе полиморфизма ДНК у лиственницы сибирской в ПЦР было амплифицировано 89 фрагментов ДНК. Используемые в ПЦР праймеры выявляли от 12 до 24 фрагментов ДНК, (в среднем 17,8). Доля полиморфных локусов ( P 95 ) у L. sibirica равна 0,988. Длины фрагментов ДНК варьировали от 170 до 1630 пар нуклеотидов. Абсолютное число аллелей ( n a ) у сосны обыкновенной составило 1,989, а эффективное число аллелей ( n е ) — 1,272. Ожидаемая гетерозиготность ( He ) равна 0,192, а информационный индекс Шеннона ( I ) — 0,327. Выявленные показатели генетического разнообразия для сосны обыкновенной и лиственницы сибирской являются высокими и соответствуют выявленными нами ранее на Урале [14 , 15].

По результатам анализа (Таблица 3) была выявлена положительная корреляция между уровнем генетического разнообразия (ожидаемая гетерозиготность — He ) и содержанием дегидроабиетиновой кислоты в пробах сосны обыкновенной и лиственницы сибирской.

Таблица 3

ГРУППЫ ДЕРЕВЬЕВ Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb. С ДАННЫМИ ОЖИДАЕМОЙ ГЕТЕРОЗИГОТНОСТИ И СОДЕРЖАНИЕМ ДЕГИДРОАБИЕТИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Группы деревьев	He	Среднее содержание дегидроабиетиновой кислоты, w(deab), %
Pinus sylvestris L.
I	0,210	28,66
II	0,222	21,98
III	0,198	19,5
IV	0,071	16,66
V	0,142	11,58
Larix sibirica Ledeb.
I	0,212	7,78
II	0,152	5,01
III	0,156	3,77
IV	0,113	2,68

Примечание:  He — ожидаемая гетерозиготность, среднее w(deab), %  — содержание дегидроабиетиновой кислоты

У P. sylvestris коэффициент корреляции между содержанием дегидроабиетиновой кислоты и ожидаемой гетерозиготностью невысок и составил 0,397 при p=0,005, а у L. sibirica высокий и равен 0,917 при p=0,005 (Рисунок 2).

Корреляционный анализ абиетиновой кислоты выявил обратную зависимость ее содержания от уровня генетического разнообразия (Таблица 4).

Larix sibirica Ledeb.

Рисунок 3. График зависимости уровня генетического разнообразия (ожидаемая гетерозиготность – He ) и содержания абиетиновой кислоты (w(abiet), %) в образцах смолы двух видов хвойных растений

Pinus sylvestris L.

Таблица 4

ГРУППЫ ДЕРЕВЬЕВ Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb. С ДАННЫМИ ОЖИДАЕМОЙ ГЕТЕРОЗИГОТНОСТИ И СОДЕРЖАНИЕМ АБИЕТИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Группы деревьев	He	Среднее содержание абиетиновой кислоты, среднее w(abiet), %
Pinus sylvestris L.
I	0,144	13,39
II	0,206	9,51
III	0,200	7,62
IV	0,216	4,985
Larix sibirica Ledeb.
I	0,171	23,77
II	0,086	16,34
III	0,107	11,89
IV	0,241	6,39

Примечание: He — ожидаемая гетерозиготность, среднее w(abiet), % — содержание абиетиновой кислоты

Для сосны обыкновенной коэффициент корреляции между содержанием абиетиновой кислоты и ожидаемой гетерозиготностью высок и составил 0,829 при p=0,005. Для лиственницы сибирской достоверной корреляции выявлено не было, коэффициент корреляции низок и составил 0,130 при p=0,005 (Рисунок 3).

Обратная зависимость между генетическим разнообразием и содержание абиетиновой кислоты у сосны обыкновенной может быть связана с тем, что основной фракцией смоляных кислот у сосны является дигидроабиетиновая кислота, а не абиетиновая [12].

Заключение

Итак, изученные образцы деревьев сосны обыкновенной и лиственницы сибирской обладают высоким генетическим разнообразием, сопоставимым с деревьями из популяций, произрастающих на Урале. Установлена корреляция между генетическим разнообразием изучаемых образцов сосны обыкновенной и лиственницы сибирской и содержанием в них абиетиновой и дегидроабиетиновой кислот. В дальнейшем необходимо изучение полиморфизма отдельных генов, ассоциированных с синтезом этих смоляных кислот у двух изученных видов хвойных растений. Это позволит расширить информацию о генетическом контроле синтеза смоляных кислот. Необходимы дальнейшие исследования с целью объяснения отрицательной корреляции между генетическим разнообразием и содержанием абиетиновой кислоты у отдельных деревьев P. sylvestris и L. sibirica, произрастающих на Урале.

Работа выполнена в рамках государственного задания №FSNF-2020-0008 ФГБОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» по науке 2020 года.