Анализ генетического разнообразия сортов масличного льна селекции ВНИИМК с применением молекулярно-генетических маркеров

Введение. Масличный лен ( Linum usi-tatissimum L . ) на современном этапе является одной из важнейших технических культур. Растет спрос на масло и семена, существует интерес к использованию льняного масла в пищевой, медицинской, парфюмерной и других отраслях промышленности. В ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК ведется селекция сортов масличного льна разнообразного направления использования, пригодных для выращивания в различных регионах РФ. В 2023 г. масличный лен в России, по данным Росстата, был высеян на площади 1410 тыс. га. Доля семян отечественной селекции составила 4

90 %, из них 73 % семян селекции ВНИИМК [1]. Успех селекционной работы в значительной мере определяется гетерогенностью используемого исходного материала. Значительное разнообразие дает селекционерам больше возможностей для отбора родительских форм для создания сортов, обладающих заданными характеристиками. Однако у культивируемых форм растений, в число которых входит и масличный лен, отмечается явное уменьшение генетического разнообразия [2]. Одним из методов выявления и поддержания разнообразия является молекулярно-генетический. С помощью молекулярно-генетических маркеров проводится генотипирование коллекций исходного материала культурных растений и решаются вопросы о вовлечении в селекционные программы в качестве родительских форм генетически удаленных образцов [3; 4]. В настоящее время наряду с маркерами однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) для дифференцировки растений внутри вида, идентификации сортов используют маркеры микросателлитных (SSR) локусов ДНК. Ранее во ВНИИМК были проведены работы по формированию информативной системы микроса-теллитных маркеров для их анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим генотипированием коллекции сортов масличного льна [5; 6; 7]. Для поддержания генетического разнообразия и идентичности масличного льна существует постоянная потребность в изучении структуры сортов-популяций [8; 9], мониторинга сортовой изменчивости в зависимости от репродукции, региона выращивания и условий года. В связи с этим целью работы была оценка генетического разнообразия некоторых сортов масличного льна селекции ВНИИМК.

Материалы и методы. В качестве материала исследования выбраны пять сортов масличного льна селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК: Даник, Снегурок, Нилин, Ы 117 и Август [10; 11; 12; 13; 14].

Для оценки генетической структуры сортов использовали 40 растений каждого сорта. ДНК выделяли из тканей отдельных растений в стадии «елочка» описанным ранее СТАВ методом [5]. Для исследования использовали 10 маркеров микросателлитных локусов [6]. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смесь, включавшей: 2,5 мкл 10-кратного Taq ДНК полимеразного буфера, 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Сибэнзим, Москва), 3 мM MgCl 2 , по 0,2 мM каждого из дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров, 0,25 мкл раствора (20 мг/мл) бычьего сыворотночного альбумина и 10 нг матричной ДНК. ПЦР выполняли в MiniAmp (Thermo Scientific, США) при соблюдении температурно-временного режима, оптимального для каждой пары праймеров. Электрофоретическое разделение ампликонов проводили в 8%-ном полиакриламидном геле в нативных условиях, в камерах вертикального электрофореза (VE-20, ДНК-технология, Россия). Окрашивание фракций амплифицированной ДНК осуществляли с помощью раствора бромистого этидия. Результаты электрофореза визуализировали при помощи гель-документирующей видеосистемы GenoSens 2200 (Clinx, КНР). Размер фрагментов ДНК определяли с использованием программного обеспечения Image Lab Software (Bio-Rad, США) относительно маркера длины фрагментов ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific. Аллельный вариант локуса обозначали числом пар нуклеотидов (п. н.) фрагмента ДНК. Основные показатели генетической изменчивости (число аллелей на локус (Na), эффективное число аллелей (Ne), наблюдаемая (Но) и ожидаемая (Не) гетерозиготности, информационный индекс Шеннона (I), индекс фиксации (F), процент полиморфных локусов (%Р), генетические дистанции (D), а также анализ молекулярной вариан-сы (АMOVA – Analysis of Molecular Variance), анализ главных координат

(Principal Coordinate Analysis, PCoA) посредством расчета матрицы расстояний со стандартизацией данных определяли с помощью программы GenAlЕx 6.5 [15].

Результаты и обсуждение . Сорта масличного льна, представляющие объект данного исследования, являются популярными, высокоурожайными сортами, к тому же несущими ряд важных хозяйственно ценных признаков. Это обуславливает их ценность как исходного материала для селекции. Для молекулярно-генетического анализа были использованы десять микросателлитных маркеров, апробированных в предыдущих исследованиях [6; 7].

Для сортов Август, Снегурок, Даник, Нилин, Ы-117 на основе аллельных вариант микросателлитных локусов Lu1, Lu3, Lu7, Lu8, Lu9, Lu10, Lu11, Lu21’, Lu24, Lu25 были рассчитаны основные показатели генетического разнообразия сортов (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1

Основные показатели генетического разнообразия пяти сортов масличного льна, выявленные с помощью анализа десяти микросателлитных локусов

Сорт	Na	Ne	I	Ho	He	F
Август	2,00	1,29	0,29	0,06	0,17	0,76
Снегурок	1,80	1,03	0,07	0,01	0,03	0,47
Даник	2,10	1,50	0,44	0,08	0,28	0,75
Нилин	3,20	1,57	0,49	0,03	0,27	0,83
Ы 117	1,40	1,23	0,18	0,00	0,11	0,98
Среднее	2,10	1,30	0,29	0,04	0,17	0,72

Примечание: Na – число аллелей на локус, Ne – эффективное число аллелей, Но – наблюдаемая гетерозиготность, Не – ожидаемая гетерозиготность, I – информационный индекс Шеннона, F – индекс фиксации

Максимальное число аллелей на локус определено для сорта Нилин (3,2). У сортов Даник, Снегурок, Август, Ы 117 этот показатель имеет меньшую величину. Показатели внутрисортового генетического разнообразия – эффективное число аллелей и индекс Шеннона, снижаются в направлении сортового ряда Нилин, Да- ник, Август, Ы 117, Снегурок. Соотношение наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности для всех анализируемых сортов происходит с численным преобладанием ожидаемой гетерозиготности, что является признаком инбредной популяции, в которой доля случайного скрещивания сведена к минимуму [2]. Это согласуется с результатами исследований С.В. Зеленцова с соавторами, показавшими, что доля перекрёстного опыления у сортов масличного льна селекции ВНИИМК варьировала в пределах 0,15–0,87 %, в отдельных случаях увеличиваясь до 1,33– 1,75 % [16]. По статистическим характеристикам (Na, Ne, I, F) сорт Нилин показал наибольшее генетическое разнообразие. По численному значению у сортов Снегурок и Ы 117 показатели гетерозиготности (He, Ho) наименьшие. Сорт Снегурок принадлежит сортам линейного типа, с наличием некоторого числа генотипов, нетипичных для сорта. Сорт Ы 117 показал однородность по восьми маркерам. По два аллеля выявлены у двух SSR-маркеров – Lu3 и Lu21ˊ. По этим маркерам у сорта выявлено два основных биотипа с различным типом сочетания аллелей: биотип Lu3175 и Lu21ˊ109 составил 55 %, а Биотип Lu3166 и Lu21 ˊ117 – 40 % от общего числа изученных растений. Оставшиеся 5 % растений, возможно, являются результатом переопыления между растениями основных биотипов, как было отмечено у Т.А. Че-люстниковой с соавторами [7]. Гетерогенность аллельного состава микросател-литных локусов у сортов Нилин, Даник, Август не позволяет отнести сорта ни к линейным, ни к сортам, обладающим четко выраженной структурой.

Изучение графиков частот аллелей сортов выявило некоторые закономерности. Каждый сорт был представлен определенным числом частных аллелей (No. Private Alleles), что позволяет четко дифференцировать изучаемые сорта. Наибольшее количество таких аллелей также было у сорта Нилин, наименьшее – у сорта Ы 117. Не было обнаружено показателя числа общих аллелей менее 25 % (No. LComm Alleles < = 25 %). А число общих аллелей менее 50 % (LComm Alleles < = 50 %) было наибольшим у сорта Даник и наименьшим у сорта Ы 117 (рис. 1).

Рисунок 1 – График распределения частот аллелей для сортов масличного льна

Август, Снегурок, Даник, Нилин и Ы 117: Pop1 – Август, Pop2 – Снегурок, Pop3 – Даник, Pop4 – Нилин, Pop5 – Ы 117. Na – число аллелей на локус, Na Freq ˃ = 5 % – частота аллелей больше 5 %, Ne – эффективное число аллелей, I – информационный индекс Шеннона, No. Private Alleles – число частных аллелей, No. LComm Alleles (< = 25 %) – число общих аллелей менее

25 %, No. LComm Alleles (< = 50 %) – число общих аллелей менее 50 %, Не – ожидаемая гетерозиготность

Процент полиморфных локусов был высоким для сортов Август (70 %), Снегурок (70 %), Даник (80 %), Нилин (80 %), низким для Ы 117 (20 %) и в среднем составил 62 %. Снегурок, который показал достаточно большой процент полиморфных локусов (70 %), обязан такому полиморфизму всего четырем растениям из 40 изученных. Эти растения имеют отличные от основного пула генотипы по семи из десяти маркеров и могут представлять собой механическое засорение. Поэтому для поддержания сорта в первоначальном состоянии рекомендуется контроль типичности не только по морфологическим признакам, присущим данному сорту, но и по молекулярным маркерам, поскольку морфологические характеристики зависят от стадии разви- тия растений и чувствительны к окружающей среде, что может привести к ложным заключениям [17].

С использованием 10 полиморфных микросателлитных локусов для всех изучаемых сортов обнаружено 50 аллелей. Наиболее полиморфным оказался локус Lu8 – у него выявлено 15 аллелей c частотой встречаемости от 0,01 до 0,96. Наименее полиморфные локусы Lu9 и Lu21’ – по четыре аллеля с частотой встречаемости от 0,01 до 0,98 (рис. 2).

F-статистика Райта показала, что генетические различия между сортами достоверны и являются высокими (Fst = 0,800, Р = 0,001) (табл. 3).

Таблица 3

Значения показателей структуры подразделенной популяции (F-статистика

Райта)

F-статистика	Значение	Вероятность (P)
Fst	0,800	0,001
Fis	0,800	0,001
Fit	0,960	0,001

Рисунок 2 – Диаграмма частоты аллелей 10 микросателлитных локусов для сортов масличного льна Август, Снегурок, Даник, Нилин и Ы 117

Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) показывает распределение общей генетической изменчивости между исследованными сортами и в их пределах. Установлено, что большая часть от общей дисперсии – 80 %, обусловлена различиями между сортами, 16 % – внутрисорто-вой гетерогенностью и 4 % – гетерозиготностью отдельных растений (табл. 2).

Таблица 2

Результаты анализа общего генетического разнообразия пяти сортов масличного льна

Источник разнообразия	Число степеней свободы (df)	Сумма квадратов (SS)	Средние квадраты (MS)	Доля в общей дисперсии,
				абс. значения	в %
Между сортами	4	1162,117	290,529	3,611	80
Внутри сортов	195	316,312	1,622	0,721	16
Внутри отдельного растения	200	36,000	0,180	0,180	4
Всего	399	1514,43		4,512	100

Генетические дистанции по Неи между сортами достаточно велики и составляют от 0,752 до 0,986. Наибольшая генетическая дистанция обнаружена между сортами Даник и Снегурок (0,997), наименьшая – между сортами Ы 117 и Нилин (0,752) (табл. 4).

Таблица 4

Генетические дистанции по Неи между сортами Август, Снегурок, Даник, Нилин, Ы 117

Генетическая дистанция	Сорт масличного льна
	Август	Снегурок	Даник	Нилин	Ы 117
Август	0,000
Снегурок	0,894	0,000
Даник	0,804	0,997	0,000
Нилин	0,909	0,873	0,952	0,000
Ы 117	0,921	0,772	0,986	0,752	0,000

Для визуализации закономерностей генетических отношений, таких как парная матрица, содержащая результаты микро-сателлитного анализа всех двухсот изучаемых растений пяти сортов, выполнили анализ главных координат (PCoA). PCoA – это многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (несколько локусов и несколько образцов). Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними [18]. PCoA, выполненный нами по двум главным координатам, расположил все сорта дистанцировано друг от друга. Однако относительно других пары сортов Август и Даник, а также Нилин и Ы 117 в пространстве главных координат расположены ближе друг к другу (рис. 3).

Рисунок 3 – Распределение сортов масличного льна в пространстве главных координат

Сорт Даник и Август получены при использовании разных селекционных программ в отличающихся экологических зонах возделывания. Даник создан на центральной экспериментальной базе ВНИИМК (г. Краснодар) методом многократного индивидуального отбора на инфекционном фузариозном фоне [10], а сорт Август – на Сибирской опытной станции ВНИИМК методом индивидуального отбора из гибридной популяции третьего поколения, отличается очень высокой устойчивостью к фузариозу [14]. И, таким образом, несмотря на отсутствие очевидного генетического родства между сортами, устойчивость к фузариозу является общей отличительной чертой этих генотипов. Сорта Нилин и Ы 117 также обладают устойчивостью к этой болезни и близки друг к другу в системе главных координат. Наиболее обособленно расположен сорт Снегурок. Он отличается от остальных изучаемых сортов высокой устойчивостью к зимним, в том числе к бесснежным, морозам и способностью выдерживать без существенных крио- повреждений отрицательные температуры до минус 20–23 °С [11].

Таким образом, проведенные исследования показали небольшое внутрисортовое и значительное межсортовое генетическое разнообразие пяти сортов масличного льна селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Изученные сорта представляют собой генетически разнородный селекционный материал и, следовательно, имеют потенциал в качестве контрастных родительских форм для селекции новых сортов.

Заключение . В результате исследования генетического разнообразия пяти сортов масличного льна Август, Снегурок, Даник, Нилин и Ы 117 по десяти микро-сателлитным локусам выявили в общем 50 аллельных вариант. Сорт Снегурок принадлежит сортам линейного типа, с наличием небольшого числа нетипичных растений, сорт Ы 117 подразделен на два основных биотипа. Гетерогенность аллельного состава микросателлитных локусов у сортов Нилин, Даник, Август не позволила отнести сорта ни к линейным, ни к сортам, обладающим четко выраженной структурой. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготности для всех проанализированных сортов соответствуют показателям инбредной популяции.     Наибольшим    генетическим разнообразием по комплексу показателей информативности отличился сорт Нилин, наименьшим – Снегурок. Август и Даник, а также Нилин и Ы 117 в пространстве главных координат расположены ближе друг к другу. Наиболее обособленно по отношению к другим расположен сорт Снегурок. Между сортами существуют значительные генетические различия. Внутрисортовая гетерогенность меньше межсортовой.