Анализ гидролиза пептидов функционально важных участков мозгового и глиального нейротрофических факторов антителами больных шизофренией и другими нейроиммунными заболеваниями

Мозговой нейротрофический фактор (от англ. Brain-Derived Neurotrophic Factor – BDNF) и глиальный нейротрофический фактор (Glial cell line-derived neurotrophic factor – GDNF) относятся к семейству белков, поддерживающих развитие и жизнеспособность нейронов [1, 2]. BDNF – один из основных нейротрофических факторов, регулирующих выживание, дифференцировку, рост и адаптацию нейрональных клеток к внешним воздействиям [3, 4]. BDNF регулирует процессы нейропластичности, совокупные с обучением и памятью, а изменение его экспрессии связано со многими патологиями, в том числе с шизофренией [5].

В литературе приводятся данные, что GDNF, так же как и BDNF, участвует в процессе эмбриогенеза и способствует выживанию разных популяций нейронов [6]. GDNF обладает нейропротективными свойствами и защищает дофаминергические нейроны [3]. Активированная микроглия продуцирует GDNF, способствуя снижению нейровоспаления [7]. Кроме того, GDNF принимает участие в синаптогенезе в гиппокампе [8].

BDNF и GDNF имеют аналогичное строение и представляют собой гомодимеры в зрелой форме [1, 2]. В структуре BDNF выделяют шпилькообразные петли 1, 2 и 4 и удлиненную петлю 3 [9]. Основную роль во взаимодействии BDNF со специфическими рецепторами TrkB и p75 играют петли 2 и 4: петля 2 взаимодействует с TrkB, а петля 4 – с рецептором p75 [10, 11]. В молекуле GDNF первые 39 N-концевых аминокислот функционально неактивны [6]. Напротив, С-концевой участок GDNF имеет решающее значение для стабилизации и биологической активности. В этом участке молекулы расположены в определенной последовательности, формируют специфические области «палец 1» и «палец 2», взаимодействующие с рецептором GFRα1 [12, 13].

Изменение уровней и функциональной активности BDNF и GDNF ассоциировано со множеством патологий, в том числе с нейро-иммунными заболеваниями [14]. Эти заболевания затрагивают как центральную нервную систему (ЦНС), так и иммунную систему, но отличаются по степени вовлеченности этих систем организма в патологический процесс [15]. К нейроиммунным заболеваниям относится шизофрения, поскольку изменения в периферической иммунной системе способствуют дисфункции ЦНС [16, 17, 18]. Нейровоспаление при шизофрении связано с когнитивными и нейроанатомическими изменениями и считается важным компонентом патогенеза заболевания [16]. Рассеянный склероз (РС) и системная красная волчанка (СКВ) относятся к нейроим-мунным заболеваниям. РС представляет собой специфическое аутоиммунное заболевание ЦНС, сопровождающееся выраженным нейровоспалением и демиелинизацией [19]. СКВ также сопровождается воспалением и связана с аутоиммунным поражением преимущественно соединительной ткани [20]. Однако до 75% взрослых и детей с СКВ могут демонстрировать симптомы поражения ЦНС на определенных этапах заболевания [20].

Таким образом, при шизофрении происходят воспалительные изменения в ЦНС, РС связан с аутоиммунным поражением ЦНС, а при СКВ иммунная дисфункция способствует вторичному повреждению тканей мозга. Сравнение таких разных нейроиммунных патологий в рамках одного экспериментального исследования может позволить выявить характерные особенности каждого из заболеваний, которые было бы невозможно обнаружить при сравнении со здоровыми лицами.

Нейроиммунные заболевания сопровождаются изменениями уровней BDNF и GDNF в крови пациентов. Результаты метаанализа указывают на снижение концентрации BDNF в крови пациентов с шизофренией по сравнению со здоровыми донорами [21]. Причем снижение наблюдалось как у пациентов с первым психотическим эпизодом, так и у больных, получающих терапию. Недавний метаанализ результатов 13 исследований выявил значительное снижение концентрации BDNF в сыворот-ке/плазме при РС [22]. Также встречаются данные о снижении концентрации BDNF при СКВ [23]. В то время как изменения концентраций GDNF при нейроиммунных заболеваниях исследованы в меньшей степени. Опубликованы данные о снижении GDNF в крови у пациентов с первым психотическим эпизодом и у хронических больных шизофренией [24, 25]. Исследования GDNF при СКВ малочисленны. Так, в одной работе показано снижение концентрации GDNF у пациентов [26], в другой, напротив, выявлено увеличение концентрации [27]. Литературные данные об изменении концентрации GDNF в крови при РС отсутствуют. Таким образом, ряд исследований указывают на снижение концентрации BDNF и GDNF при некоторых нейроиммунных заболеваниях, особенно при шизофрении.

Снижение концентрации нейротрофических факторов может быть связано с уменьшением их образования или интенсивным распадом. Разрушение нейротрофических факторов может происходить под действием протеолитических ферментов. Сравнительно недавно нами обнаружено, что некоторые аутоантитела проявляют протеолитические свойства [28]. Мы выдвинули гипотезу о том, что такие каталитические антитела могут разрушать нейротрофические факторы при нейроиммунных заболеваниях. Первым примером каталитических антител были IgG, гидролизующие вазоактивный интестинальный пептид (ВИП) [29].

Продемонстрировано, что ВИП продуцируется в различных тканях, включая центральную и периферическую нервную систему, и выполняет функцию нейротрансмиттрера, нейромодулятора и цитокина [30]. BDNF и GDNF также выполняют сигнальные и трофические функции. В связи с этим вполне вероятно, что при нейроиммунных заболеваниях образуются антитела, гидролизующие BDNF и GDNF.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проанализировать уровень гидролиза пептидов из функционально важных участков BDNF и GDNF антителами больных шизофренией и другими нейроиммунными заболеваниями, такими как РС и СКВ.

Цель сформулирована, исходя из выдвинутой нами гипотезы, что IgG с протеолитическими свойствами при шизофрении и других нейроиммунных заболеваниях способны гидролизовать BDNF и GDNF. Однако из-за дороговизны высокоочищенных нейротрофических факторов человека и необходимости больших количеств этих белков для анализа было принято решение провести скрининг антител и проанализировать гидролиз не полных молекул белков, а функционально важных пептидных фрагментов BDNF и GDNF.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В общую (n=112) выборку исследования вошли 30 здоровых добровольцев, а также пациенты с установленными по МКБ-10 диагнозами: параноидная шизофрения (F20.0) ‒ n=20, СКВ (М32) ‒ n=32, РС (G35) ‒ n=30. От каждого участника было получено добровольное информированное согласие на участие в эксперименте. Отбор пациентов с шизофренией проводился в отделении эндогенных расстройств НИИ психического здоровья Томского НИМЦ (Томск). Отбор здоровых доноров и больных СКВ выполнен в НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (Новосибирск). Отбор больных РС организован на базе Областного центра неврологии и нейрохирургии Новосибирской областной больницы (Новосибирск). Средний возраст обследованных не имел статистически значимых (р>0,05) различий: здоровые доноры ‒ 36,8±11,2 года, больные шизофренией – 40,0±11,3 года, пациенты с СКВ – 39,1±13,4 года, пациенты с РС – 34,8±12,6 года. У большинства (n=13, 65%) пациентов с шизофренией превалирующая негативная симптоматика встречалась чаще, чем позитивная симптоматика (n=7; 36%). Пациенты с СКВ в основном находились в активной стадии заболевания, средний индекс SELENA-SLEDAI составил 6,5±3,4 балла. Половина пациентов с РС имели рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (РРРС), другая половина – первично-прогрессирующий рассеянный склероз (ППРС). Группы здоровых доноров, больных шизофренией и РС имели сопоставимое соотношение мужчин и женщин, но в группе больных СКВ превалировали женщины (87,5%).

Для забора венозной крови натощак применяли вакуумные пробирки Vacuette (Greiner Bio-One, Австрия) с активаторами свертывания. Полученную после центрифугирования сыворотку крови использовали для анализа.

Для выделения IgG из сыворотки крови применяли метод аффинной хроматографии, описанный ранее [31]. Многократно показано, что этот метод позволяет получать гомогенные препараты IgG, не содержащие примесей других белков и ферментов. Полученные препараты IgG использовали для анализа пептидазной активности, а в качестве субстратов для анализа пептидазной активности ‒ флуоресцентно меченые (по N-концу 5-карбоксифлуоресцеином ‒ 5-FAM) пептиды функционально важных участков BDNF и GDNF. В таблице 1 представлены описание и биологическая роль пептидов.

Т аблица 1. Описание пептидов ‒ фрагментов нейротрофических факторов, использованных в работе

Нейротрофический фактор	Название пептида	Последовательность аминокислот (АК)	Число АК	Описание и биологическая роль пептида
BDNF	L2	T V L E K V P V S K G Q L K Q Y F Y E T K	21	Фрагмент петли 2 BDNF, которая взаимодействует с рецептором TrkB
	L4	R A L T M D S K K R I G W R F I R I D T	20	Фрагмент петли 4 BDNF, которая взаимодействует с рецептором p75
GDNF	Gf1	E T K E E L I F R Y C S G S C D A A E T	20	Фрагмент области «палец 1» молекулы GDNF, которая взаимодействует с рецептором GFRα1
	Gf2	A F D D D L S F L D D N L V Y H I L R K H	21	Фрагмент области «палец 2» молекулы GDNF, которая взаимодействует с рецептором GFRα1

Для BDNF использовали два пептида ‒ L2 и L4, представляющие собой фрагменты петли 2 и петли 4, взаимодействующие с TrkB или p75 рецепторами [9, 10, 11]. В случае GDNF так же применяли два пептида ‒ Gf1 и Gf2, представляющие собой фрагменты области «палец 1» или «палец 2», взаимодействующие с рецептором GFRα1 [12, 13]. Пептиды синтезированы и очищены (компания Biomatik, Онтарио, Канада).

Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала следующие компоненты: 50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 30 мМ NaCl и 0,1 мМ одного из исследуемых олигопептидов (табл. 1), растворенных в диметилсульфоксиде и 0,4 мг/мл (2,7 мМ) IgG. Трипсин, α-химотрипсин и протеиназу К использовали в качестве положительного контроля в конечной концентрации: 120 U/мл, 0,5 U/мл и 0,5 U/мл соответственно. Реакционную смесь, не содержащую антител или протеаз, использовали в качестве отрицательного контроля. Реакцию гидролиза проводили в термостате при 37°С в течение 15 минут (для реакций с протеазами) или 20 часов (для реакций с антителами). Для анализа продуктов гидролиза олигопептидов использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) в соответствии с представленным описанием [32]. Реакционные смеси (2 мкл) наносили на пластины TLC Silica gel 60 F254 с алюминиевой подложкой (Merck, Германия). Для разделения продуктов использовали хроматографическую смесь, состоящую из уксусной кислоты, n-бутанола, ddH2O в соотношении 1:4:5. Затем пластины высушивали и оценивали флуоресценцию (Abs λmax=495 нм, Em λmax=520 нм) на лазерном сканере (Amersham TyphoonTM, Cytiva, Германия).

Полученные хроматограммы анализировали в программе ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics, США). Относительную пептидазную активность препаратов IgG определяли из соотношения интенсивности исходного пятна пептида к интенсивности продуктов гидролиза. За 100% принимали полный гидролиз пептида. Статистический анализ проводили в программе Origin 2019b (OriginLab, США). Для оценки значимости различий использовали критерий Манна–Уитни, поскольку данные не подчинялись нормальному закону распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рисунке 1 представлен пример результатов анализа ТСХ гидролиза пептида L2 препаратами IgG здоровых доноров, больных СКВ, РС и шизофренией. Продукты гидролиза, образующиеся под действием протеаз и антител, отличаются, но некоторые из них имеют сходство (рис. 1). Антитела здоровых доноров практически не обладали активностью, а эффективность гидролиза под действием IgG пациентов различается. Аналогичные результаты получены с использованием других пептидов .

Протеазы IgG здор.

IgG СКВ

К К К1 К2 КЗ 1 2 3

Линия фронта

Продукты Исходный субстрат

Линия старта

Рисунок 1. Анализ продуктов гидролиза пептида L2 препаратами IgG здоровых доноров, больных системной красной волчанкой, рассеянным склерозом и шизофренией методом тонкослойной хроматографии

П р и м е ч а н и е. ДорК – отрицательный контроль, дорК1 – α-химотрипсин, дорК2 – протеиназа К, дорК3 – трипсин, дор1, дор2, дор3 – IgG здоровых доноров, дор4, дор5, дор6 – IgG больных системной красной волчанкой, дор7, дор8, дор9 – IgG больных рассеянным склерозом, дор10, дор11, дор12 – IgG больных шизофренией.

На рисунке 2 представлены результаты анализа относительной пептидазной активности (%) препаратов IgG больных СКВ, РС, шизофренией и здоровых доноров. Показано, что уровень гидролиза всех четырех пептидов препаратами IgG пациентов с СКВ, РС и шизофренией статистически значимо выше, чем у здоровых доноров. Однако в случае гидролиза пептида Gf2 препаратами IgG больных шизофренией не обнаружено статистически значимых различий в уровне гидролиза по сравнению со здоровыми донорами (рис. 2 Г).

Пептиды L2, L4 и Gf1 наиболее эффективно (по медианным значениям) гидролизовались препаратами IgG больных шизофренией и хуже всего – препаратами IgG пациентов с РС. В то время как пептид Gf2 лучше всего гидролизовался препаратами IgG больных РС и хуже всего – антителами больных шизофренией. Таким образом, эффективность IgG-зависимого гидролиза различается в зависимости от пептида и заболевания, что указывает на различную специфичность антител при нейроиммунных заболеваниях.

Р и с у н о к 2. Относительная пептидазная активность (%) препаратов IgG больных системной красной волчанкой, рассеянным склерозом, шизофренией и здоровых доноров в реакции гидролиза пептидов L2 (А), L4 (Б), Gf1 (В), Gf2 (Г)

П р и м е ч а н и е. За 100% принят полный гидролиз пептида. Статистическая значимость различий рассчитана с использованием критерия Манна–Уитни.

Уровень относительной пептидазной активности в гидролизе четырех пептидов статистически значимо (p<0,01) отличался при трех нейроиммунных заболеваниях. Однако не выявлено статистически значимых (р>0,05) различий между уровнями гидролиза L4 препарата- ми IgG при СКВ и шизофрении, а также IgG при СКВ и РС. Отсутствовали статистически значимые (р>0,05) различия между уровнями гидролиза пептида Gf1 препаратами IgG больных СКВ и шизофренией, а также уровнями гидролиза Gf2 антителами больных СКВ и РС.

Таким образом, в результате проведенного анализа выявлено, что препараты IgG пациентов эффективно гидролизовали пептиды L2, L4, Gf1 и Gf2. При этом препараты IgG больных шизофренией обладали наибольшей активностью в гидролизе пептидов L2, L4 и Gf1 по сравнению с IgG при РС и СКВ. Полученные данные указывают на то, что при исследуемых нейроим-мунных заболеваниях образуются каталитические антитела, специфически распознающие и гидролизующие пептиды BDNF и GDNF. Однако в дальнейшем эффекты каталитических антител необходимо проверить на полноразмерных молекулах нейротрофических факторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По итоговым материалам работы впервые показано, что IgG при нейроиммунных заболеваниях гидролизуют пептиды BDNF и GDNF. Учитывая, что используемые в работе пептиды представляют собой фрагменты функционально важных участков BDNF и GDNF, гидролиз этих участков антителами может нарушать функционирование этих нейротрофических факторов. Также можно предположить, что образующиеся антитела гидролизуют и другие участки молекул нейротрофических факторов. Снижение уровней BDNF и GDNF при некоторых нейроиммунных заболеваниях [21, 22, 24, 26] может частично объясняться воздействием каталитических антител. Аутоантитела к цитокинам и ростовым факторам обнаружены как у здоровых доноров (низкий титр), так и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (высокий титр) [33, 34]. Считается, что такие аутоантитела регулируют избыточную экспрессию цитокинов. Возможно сделать предположение, что антитела к нейротрофическим факторам при нейроиммунных заболеваниях образуются схожим образом и выполняют аналогичные функции. Полученные данные дополняют и расширяют наши представления о неканонических свойствах иммуноглобулинов и разнообразии функциональных возможностей этих молекул [28].