Анализ локусов, кодирующих факторы патогенности Haemophilus parasuis

Работа выполнена при поддержке Министерства сельского хозяйства РФ.

mophilus parasuis (сем. Pasteurellaceae ), имеющая специфическое требование к ростовой среде — наличие никотинамидадениндинуклеотида (НАД) (4). У свиней бактерии этого вида входят в состав нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей, но существуют штаммы H. parasuis , способные преодолевать колонизационную резистентность животных и вызывать болезнь (5). Возбудитель передается поросятам при прямом контакте от свиноматок-бактерионосителей в первые дни жизни, однако заболевание обычно проявляется через 8-15 сут после отъема. Появлению вирулентных штаммов способствует высокая генетическая изменчивость бактерий (6), в результате которой авирулентные штаммы приобретают способность вызывать заболевание.

Изучение факторов патогенности методами молекулярной биологии выявило множество различий в геноме вирулентных и авирулентных штаммов, свидетельствующих о необходимости комплексного анализа изо-лятов H. parasuis из разных стран (7). Ряд авторов (8-10) идентифицировали гены, кодирующие потенциальные факторы вирулентности — белки внешней мембраны, выполняющие транспортную ( vtaA , fhuA , hhdA , hhdB , nhaC , HAPS_0254 , cirA ) и адгезивную ( sclB7 , sclB11 ) функции. Фаговые гены ( phage_related ) способны кодировать токсины и участвовать в возникновении патогенных микроорганизмов в результате горизонтального переноса генетического материала (11).

Взаимосвязь между биологическими свойствами бактерий и наличием генов вирулентности остается до конца не изученной. Идентификация генов вирулентности может помочь в разработке новых методов типи-рования и новых вакцин, которые обеспечат более длительную и эффективную защиту от патогенных штаммов H. parasuis .

Мы впервые провели генетический скрининг штаммов и изолятов H. parasuis , выделенных на территории Российской Федерации с 2000 по 2011 год, на наличие 10 факторов патогенности (соответствующие локусы — vtaA , fhuA , hhdA , hhdB , nhaC , cirA , HAPS_0254 , sclB7 , sclB11 и phage_related ) и установили их присутствие в разных комбинациях. У 15 из 28 изученных представителей H. parasuis , выявленных на территории РФ, нами обнаружены сочетания локусов, которые до этого не были описаны. Кроме того, показано, что три авирулентных штамма и изолята содержат ген vtaA группы 1, ранее считавшийся характерным только для потенциально вирулентных штаммов.

Целью нашей работы было определение генотипических факторов патогенности у изолятов Haemophilus parasuis , выделенных на территории Российской Федерации.

Методика . Штаммы и изоляты Haemophilus parasuis , которые были использованы: типовой штамм H. parasuis ATCC 19417 (4-й серотип, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, США); изоляты AI4, SW124, NAG, D21, D95, SH6, V171, TO1, T72, NB144 (получены из ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, пос. Оболенск); штаммы ИН-1-ДЕП, ИЛ-1-ДЕП, Уральский ДЕП, КОМИ ДЕП и СК-1-ДЕП (депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов — ВГНКИ, г. Москва); изоляты BEL, Ботово-2, Ботово-5, Ботово-6, Ботово-7, VN, LUB, IL2, IL3, MB, MB1, Надеево-2, SK3 (получены сотрудниками Федерального центра охраны здоровья животных в период с 2000 по 2011 год на территории РФ из патологического материала животных с клиническими признаками гемофилезного полисерозита). Культуры H. parasuis выращивали на агаре, приготовленном на основе Bacto Triptone, Bacto Peptone 492

и агара Difco («BD», Нидерланды). После стерилизации агара к 250 мл среды добавляли 25 мл дрожжевого экстракта (источник НАД), 25 мл эритроцитов лошади и 25 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Бактерии культивировали при 37 ° С в атмосфере с 5 % CO 2 в течение 24-48 ч.

Биохимические признаки изучали с помощью прибора VITEK 2 Compact и карт для идентификации требовательных микроорганизмов VITEK 2 NH ID Card («bioM e rieux SA», Франция).

Бактериальную ДНК выделяли из чистых культур, используя комплект реагентов РИБО-сорб («ИнтерЛабСервис», г. Москва) согласно инструкции изготовителя.

Принадлежность НАД-зависимых бактерий к виду H . parasuis определяли с помощью PCR в реальном времени (real-time PCR) c праймерами и зондом, разработанными С. Turni с соавт. (12). Условия постановки реакции были описаны ранее (13).

Гены, которые предположительно связаны с патогенностью, выявляли методом PCR с десятью парами праймеров (8-10). Температурные режимы устанавливали аналогично предложенным (8-10). PCR проводили в реакционной смеси следующего состава: по 0,4 мкмоль/л каждого из dNTP («Fermentas», Литва), 0,4 мкмоль/л праймеров («Синтол», г. Москва), 3 ммоль/л MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы, 1 х Green Buffer («Promega», США) и 5 мкл ДНК. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза при 130 V в течение 15 мин в 1,5 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл).

Оценку статистической значимости взаимосвязи между наличием гена и патогенностью референтных штаммов (на основе данных литературы) проводили при сравнении коэффициента корреляции х ² (14). Для вычисления достигаемого уровня значимости использовали односторонний точный тест Фишера (14).

Результаты . Проверка штаммов и изолятов на принадлежность к виду H . parasuis на основании биохимических признаков показала, что все культуры бактерий не проявляли уреазную и оксидазную активность, но были положительными по каталазе, не образовывали индол и обладали ферментативной активностью в отношении глюкозы, галактозы, маннозы, что соответствует критериям вида H . parasuis согласно определителю Берджи (15). Все культуры были также положительными в видоспецифичной для H. parasuis real-time PCR.

В последние несколько лет c помощью супрессионной вычитающей гибридизации (8, 16), репрезентативного разностного анализа (10) и секвенирования (9, 17, 18) идентифицирован ряд генов, связанных с вирулентностью, но взаимосвязь между биологическими свойствами изолятов и наличием этих генов полностью не изучена. Мы выполнили скрининг генов, связанных с вирулентностью, и сопоставили их биологические и молекулярно-генетические свойства, обнаруженные в настоящей работе, с данными по референтным штаммам, представленными в литературе.

Для выявления генов vtaA , fhuA , sclB11 , nhaC , sclB7 , HAPS_0254 , hhdA , hhdB , cirA и phage_related , которые, как предполагается, связаны с патогенностью, использовали десять пар праймеров (табл. 1).

• 1.    Праймеры, использованные при выявлении потенциальных генов патогенности у Haemophilus parasuis

  Ген		Название праймера	Нуклеотидная последовательность (5' ^ 3')	Длина ампликона, п.н.	Авторы праймеров
  vtaA	YADAF1 PADHR1		TTTAGGTAAAGATAAGCAAGGAAATCC CCACACAAAACCTACCCCTCCTCC	406	(9)

• 2.    Наличие генов предполагаемых факторов патогенности у изученных штаммов и изолятов Haemophilus parasuis , использованных в эксперименте

  Штамм, изолят

  Ген vtaA 1 fhuA 1 sclB11 1 nhaC sclB7 HAPS_0254 hhdA 1 hhdB 1 cirA phage_related

  Типовой штамм ATCC 19417 Штамм ИЛ-1-ДЕП Штамм ИН-1-ДЕП Штамм СК-1-ДЕП Штамм Уральский ДЕП Штамм КОМИ ДЕП Изолят BEL Изолят Ботово-2 Изолят Ботово-5 Изолят Ботово-6 Изолят Ботово-7 Изолят VN Изолят LUB Изолят IL2 Изолят IL3 Изолят Краснодар Изолят MB Изолят SK3 Изолят Надеево-2 Изолят AI4 Изолят D21 Изолят D95 Изолят SH6 Изолят V171 Изолят TO1 Изолят T72 Изолят NB144 Изолят NAG Изолят SW124 Всего

  +         +          + +   +    +    +    +      +      +    +   + +         +          + +                    + +   +    +    +    +      +            +   + +   +    +    +    +      +      +    +   + +         +          + +   +    +          +      +      +    +   +      + +         +          +                         + +         +          + +   +    +    +    +      +      +         + +         +    +    +      +      +    +   +      + +         +          +                         + +   +    +          +      +      +    +   + +   +    +    +    +      +      +    +   + +                    + +         + + +   +    +    +    +      +      +    +   + +   +    +          +      +      +         + +   +    +    +    +      +      +    +   +      + +         +          + +   +    +    +    +              +    +   + +         + +   +    +    +    +      +      +    +   + +   +    +    +    +      +      +    +   + +         + +   +    +    +    +      +      +    +   + +   +    +          +      +      +    +   + 29    15     26      12     25        15        15     14    18         3

Продолжение таблицы 1

fhuA	E35-F E35-R	TCTAAGCGATGGGATTGAGC GGTGGCGTAAGACGTGATT	461	(8)
sclB11	A4-F	TTTGGCGTTTGATGAGTT	186	(8)
	A4-R	TGGCGTTAGGTTATGGTT
nhaC	E30-F	GTCCAGGAAGCATAATACA	312	(8)
	E30-R	TACAAGGTGGCGAGATAA
sclB7	D32-F	CATTGGCAGAGGCTTTAT	242	(8)
	D32-R	GTACGGTATTGCGGTTGG
HAPS_0254	B14-F	ACACCTTATGCTTCCGCTAT	146	(8)
	B14-R	ACGGTAACAGAACAAGAGCC
hhdA	MP_A1	GGTTCTAGTTCACAAACAGCCAATAC	964	(10)
	MP_A2	GATATTTACCCCTGCCTTCATTGTATC
hhdB	MP_B1	ATCTTGCCCTGATTAGAGAGTAGGAGT	557	(10)
	MP_B2	GTGAATATAGCCCTTATCCAAATAGGC
cirA	MP_CirA1	GTATGCAGAATAAAGCCCTGCTAAAC	215	(10)
	MP_CirA4	CTGTAAAGCAATGCAATTACCGTAGTG
phage_related Ophage13_1		GCTTGCGGGTAATCTGTTGT	301	(10)
	Ophage13_2	AGAATCAACCTCAGCCGAAA
infB	CTinfF1	CGACTTACTTGAAGCCATTCTTCTT	74	(12)
	CTinfR1	CCGCTTGCCATACCCTCTT
	CTinfP	FAM-ATCGGAAGTATTAGAATTAAGTGC–BHQ1

П р и м еч а ни е. Происхождение штаммов и изолятов см. в разделе «Методика»; «+» — наличие, пропуск — отсутствие гена.

Результаты проверки штаммов и полевых изолятов H. parasuis на наличие генов, кодирующих предполагаемые факторы патогенности, показали присутствие всех из них в разных комбинациях (табл. 2). Среди 28 штаммов и изолятов H. parasuis , выделенных на территории РФ, ген vtaA встречался у всех представителей, гены sclB7 и sclB11 — соответственно в

24 и 25 случаях, гены cirA — в 18 из 28, fhuA, HAPS_0254 и hhdA — в 15 из 28, hhdB — в 14 из 28, nhaC — в 12 из 28, phage_related — лишь в 3 из 28 образцов. Более половины (15 из 28 — LUB, Уральский ДЕП, MB, СК-1-ДЕП, SK3, Краснодар, Ботово-2, Ботово-5, Ботово-7, IL2, AI4, V171, SH6, SW124, VN) обладали уникальным сочетанием генов, не описанным до настоящего времени в литературе.

Оценка патогенных свойств изолятов представляет собой один из необходимых этапов в биологической характеристике вновь выявленных штаммов. Однако в настоящее время дорогостоящей проверке вирулентности на лабораторных животных не существует альтернативы (19). В связи с этим поиск генов, ответственных за патогенность H. parasuis , остается актуальной задачей, над которой работают многие исследователи. Методами генной инженерии удалось выявить потенциальные гены, отличающие вирулентные штаммы от авирулентных (8-10). К сожалению, роль этих генов в патогенезе заболевания остается неизученной, к тому же генетический скрининг большего числа изолятов H. parasuis из разных стран позволил бы глубже понять роль этих генов в симптоматике, связанной с конкретным изолятом.

Анализ генов (8-10), кодирующих факторы патогенности, у 15 референтных штаммов H. parasuis выявил корреляцию (p < 0,05) вирулентных свойств этих штаммов с наличием 8 генов: vtaA , fhuA , sclB11 , nhaC , sclB7 , HAPS_0254 , hhdA и hhdB (8-10). В настоящей работе мы изучили 5 штаммов и 23 изолята, выделенные в 13 субъектах РФ от свиней с клиническими признаками гемофилезного полисерозита (см. табл. 2), с проведением скрининга по 10 локусам, которые, согласно данным литературы, могут отвечать за вирулентность.

Локус vtaA наиболее полно охарактеризован в качестве гена фактора патогенности у H. parasuis (17, 20, 21). Кодируемое им семейство белков образует β-складки во внешней мембране грамотрицательных бактерий (17, 20, 21). У разных бактерий vtaA вовлечен в обеспечение адгезии к клеткам хозяина, противодействия сывороточных антител и избегания фагоцитоза (17, 20, 21). Мы установили наличие гена vtaA группы 1 у всех 28 изученных российских штаммов и изолятов. Однако A. Olvera с соавт. (9) при исследовании референтных штаммов обнаружили ген vtaA у всех высоко- и средневирулентных штаммов и только у одного авирулентного (штамм 174 7-го серотипа). В исследованиях по валидации использованной этими авторами тест-системы на полевых пробах ген vtaA был выявлен в 41,5 % образцов материала (носовые смывы) от животных из хозяйств, благополучных по гемофилезному полисерозиту, но тем не менее содержащих геном H. parasuis (9, 22). Таким образом, выявление гена vtaA во всех российских штаммах и изолятах H. parasuis подтверждает факт их выделения от свиней с клиническими признаками гемофилезно-го полисерозита и служит свидетельством потенциальной патогенности этих бактерий. Ген cirA, кодирующий белок-переносчик железа, мы обнаружили у 18 из 28 представителей H. parasuis, выделенных на территории РФ. Первоначально этот ген был выявлен M. Sack и N. Baltes (10) как один из локусов высоковирулентного штамма Nagasaki (5-й серотип), вероятно, ассоциированных с патогенностью. Всего авторы идентифицировали 4 гена (hhdA, hhdB, cirA и phage_related), экспрессия которых была подтверждена у штамма Nagasaki с помощью PCR с обратной транскрипцией (10). Позднее K.J. Howell и соавт. (23) при исследовании более 200 штаммов H. parasuis установили, что cirA — один из 10 наиболее часто встречающихся генов, кодирующих потенциальные факторы пато- генности, а локусы hhdA, hhdB — это псевдогены, которые не экспрессируются из-за мутаций в рамке считывания. В работе P. Assavacheep с со-авт. (24) в образцах биологического материала от павших свиней с помощью такой же системы праймеров ген hhdA выявили в 12 из 20 образцов, а hhdB — в 8 из 20 образцов. При скрининге российских изолятов мы обнаружили гены hhdA и hhdB соответственно у 15 и 14 представителей H. parasuis. К сожалению, эпидемиологические данные по остальным генам в доступной литературе отсутствуют.

При анализе связи между наличием генов и биологическими свойствами H. parasuis мы использовали результаты А.В. Потехина с соавт. (25), исследовавших патогенность штаммов ИЛ-1-ДЕП, СК-1-ДЕП, КОМИ ДЕП и изолятов Краснодар, Надеево-2, Ботово-2 на мышах, морских свинках и поросятах (табл. 3).

3. Результаты определения патогенных свойств бактерий Haemophilus parasuis при экспериментальном заражении беспородных свиней в условиях вивария (25)

Штамм, изолят	Число животных, гол.
	с клиническими признаками	павших	с патологически ми изменениями	от которых выделена культура
Штамм ИЛ-1-ДЕП	4	2	4	4
Штамм СК-1-ДЕП	0	0	0	0
Изолят Краснодар	3	0	3	3
Штамм КОМИ ДЕП	3	0	2	1
Изолят Надеево-2	1	0	0	0
Изолят Ботово-2	0	0	0	0
Контроль	0	0	0	0

Шесть представителей H. parasuis (ИЛ-1-ДЕП, IL3, T72, TO1, КОМИ ДЕП, Надеево-2) по наличию 9 локусов и отсутствию локуса phage_related совпали с высоковирулентными референтными штаммами IA-84-17975 (13-й серотип), IA-84-22113 (14-й серотип) и средневирулентным штаммом SD-84-15995 (15-й серотип) (8-10). Несмотря на то, что штаммы ИЛ-1-ДЕП, КОМИ ДЕП и изолят Надеево-2 обладали одинаковыми факторами патогенности, их биологические свойства сильно различались: ИЛ-1-ДЕП вызвал гибель двух из четырех поросят, что свидетельствует о его высокой вирулентности; заражение КОМИ ДЕП приводило к тотальному поражению серозных оболочек плевральной, перикардиальной и перитонеальной полостей (штамм проявил среднюю вирулентность); у животных, экспериментально инфицированных изолятом Надеево-2, клинические признаки заболевания отсутствовали (25).

У поросят, зараженных изолятом Краснодар, в течение первых 3 сут наблюдали угнетенное состояние, отказ от корма и повышение температуры тела до 40,5-41,0 ° С. Болезнь проходила с признаками полисерозита и с выпадением нитей фибрина во внутренние полости (25). В геноме этого изолята, который ранее был охарактеризован как средневирулентный, нами были выявлены локусы vtaA и sclB7 — те же, что у непатогенного штамма СК-1-ДЕП. Таким образом, гены, которые предположительно кодируют факторы вирулентности, мы обнаружили и у патогенных, и у непатогенных представителей H. parasuis . Например, оказалось, что авирулентный изолят Ботово-2 содержал 9 из 10 локусов (отсутствовал ген nhaC ), а ави-рулентный штамм СК-1-ДЕП — только 2 ( vtaA и sclB7 ), причем эти сочетания локусов уникальны и не описаны в литературе. В целом более чем у половины изученных штаммов и изолятов (15 из 28) мы выявили сочетания генов, не встречающиеся, по данным литературы, ни у одного из 15 референтных штаммов всех 15 серотипов (8-10), что отражает высокую генетическую изменчивость бактерий (23) и свидетельствует о большем раз-496

нообразии генотипов, чем серотипов (26). Следует также отметить, что авторы работ, в которых идентифицировали потенциальные факторы патогенности, определили гены только у 15 референтных штаммов, используемых для серотипирования, тогда как наша работа — одна из немногих, в которых гены, кодирующие потенциальные факторы патогенности, выявляли у полевых изолятов.

Полученные нами данные подтверждают гипотезу о мультифактор-ном характере вирулентности у H. parasuis , проявление которой зависит от генетических свойств бактерии и иммунологического статуса зараженного животного (27). Предпринятое изучение единичных локусов потенциальных факторов патогенности, конечно, недостаточно для глубокого анализа проблемы, но оно показывает необходимость разработки реалистичной модели заражения с привлечением методов системной биологии, полногеномного секвенирования и протеомного анализа для исследования максимально возможного числа изолятов (23, 28-30).

Итак, у 28 изученных представителей Haemophilus parasuis , выделенных на территории Российской Федерации, установлено присутствие всех генов, предположительно кодирующих факторы патогенности ( vtaA , fhuA , hhdA, hhdB , nhaC , cirA , HAPS_0254 , sclB7 , sclB11 и phage_related ), в разных комбинациях. При этом у 15 обнаружены сочетания локусов, не описанные до настоящего времени в литературе. При сопоставлении полученных результатов с данными проведенных ранее исследований патогенности этих штаммов и изолятов для свиней и лабораторных животных интересным оказался тот факт, что штаммы ИЛ-1-ДЕП, КОМИ ДЕП и Надеево-2, обладающие одинаковым набором генов, характерным для патогенных штаммов 13-го, 14-го и 15-го серотипов, проявили соответственно высоковирулентные, средневирулентные и авирулентные свойства. Кроме того, нами было показано, что авирулентные штаммы содержат ген vtaA группы 1, ранее считавшийся характерным только для потенциально вирулентных штаммов.