Анализ метилирования генов SHOX2, TGFBR1, MIR-375 в различных типах рака легких

Метилирование ДНК является важным эпигенетическим процессом, играющим огромную роль в фундаментальных биологических собы- тиях, таких, как развитие и дифференцировка клеток [1]. Нарушение этого процесса играет важную роль в канцерогенезе [2], а аберрантное метилирование ДНК является отличитель- ной чертой возникновения рака у человека. [3, 4]. В настоящее время анализ метилирования ДНК является ценным источником при поиске биомаркеров рака [5]. Маркеры на основе метилирования ДНК представляют большой интерес в тех случаях, когда трудно поставить диагноз, используя обычные диагностические процедуры. Кроме того, материал для исследования маркеров метилирования может быть получен малоинвазивными способами. В то же время профили метилирования ДНК в значительной степени отличаются в различных типах раковых клеток и могут быть использованы для установления типа опухоли и определения лекарственной чувствительности.

Недавно был обнаружен ценный биомаркер, основанный на метилировании гена SHOX2, для выявления рака легких в бронхиальных аспиратах. [6]. Ген SHOX2 является членом семейства гомеобоксных генов, кодирующих белки, содержащих мотив из 60-аминокислотных остатков, который представляет собой ДНК-связывающий домен. Гомеобоксные гены были широко охарактеризованы как транскрипционные регуляторы. Увеличение числа копий гена SHOX2 было признано одним из самых распространенных и значимых хромосомных перестроек при раке легкого [7-11]. В то же время, ненормальное метилирование гена SHOX2 является отличительной чертой раковых опухолей легких и коррелирует с увеличением числа копий участка локуса 3q25.3 [12, 13].

Метилирование гена SHOX2 обнаруживается при злокачественной трансформации легких даже у пациентов с отрицательным результатом по цитогистологии [14, 15]. Стоит отметить, что метилирование гена SHOX2 наблюдается в различных гистологических подтипах рака легких [12, 14-16], с особенно высокой частотой при мелкоклеточном и плоскоклеточном раке легкого [16]. Однако, в настоящее время не хватает информации о молекулярном механизме регулирования SHOX2 .

SHOX2 действуя как транскрипционный фактор: повышает активность экспрессии трансформирующего фактора роста β-рецептора I (TβR-I). [17]. В течение последнего десятилетия tgf-β-сигнальный путь является одним из главных путей развития рака из-за его способности регулировать клеточный рост и дифференцировку. Различные члены суперсемейства tgf-β часто мутируют при раке [18, 19]. В нормальных клетках ТФР-β действует как супрессор опу- холи, ингибируя рост клеток, способствуя клеточной дифференцировке, и/или индуцируя апоптоз. Однако, в ходе поэтапного перехода от предраковых злокачественных клеток, ТФР-β утратил ингибирующие свойства из-за потери функциональных рецепторов и внутриклеточных мессенджеров в tgf-β-сигнальном пути [20, 21]. Предполагается, что метилирование промотора компонентов суперсемейства tgf-β является одним из основных способов инактивации ТФР-β сигнального пути [22, 23].

С другой стороны, было показано, что SHOX2 является мишенью mir-375 при эпителиальномезенхимальном переходе в клетках рака молочной железы [17]. Ранее сообщалось, что метилирование микроРНК mir-375 при немелкоклеточном раке легкого достаточно частое событие [24].

Материалы и методы

Образцы опухолей и гистологически нормальной ткани легкого от 187 пациентов (характеристики образцов даны в табл.1), которые подписали информированное согласие на проведение исследования и до операции не получавшие лучевую или химиотерапию, были собраны и клинически охарактеризованы в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Татарстан (г. Казань) в 2014-2016 гг. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классифкацией Международного противоракового союза и описаны гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [25, 26]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3-5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Образцы тканей хранили при -70°С.

Выделение ДНК. Геномную ДНК из легочной ткани пациентов выделяли на автоматической станции QIAcube по протоколу Blood and body fluid spin protocol V3. Контроль количества и качества ДНК осуществляли с помощью спектрофотометра NanoVue Plus (GE Healthcare).

Бисульфитная конверсия. Бисульфит-ную конверсию ДНК осуществляли с помощью набора EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit по протоколу Quick-StartProtocol. Очистку после конверсии проводили на автоматической станции QIAcube по протоколу Cleanup of 100 ng or more bisulfite converted DNA. В качестве контро- лей использовали геномную ДНК Jurkat (НПО «СибЭнзим») обработанную CpG-метилазой M.Sss I и геномную ДНК L-68 (НПО «СибЭн-зим»).

РТ-ПЦР. Амплификацию промотерных областей исследуемых генов проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» на термоциклере “ABI StepOnePlus” (Applied Biosystems). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва, флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез», г. Москва). Условия амплификации фрагментов ДНК: 950C/2 мин – 1-й цикл; 940C/10 сек, 58-660C/60сек – 40 циклов, условия ПЦР, последовательности праймеров, флуоресцентных зондов приведены в табл. 2.

Статистический анализ проводили с при- менением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0.05. Расчеты проводили с помощью программы для статистического анализа данных STATISTICA 10.

Результаты и обсуждения

При изучении метилирования использовался метод RQ анализа, который позволяет провести достаточно точное сравнение уровня метилирования матрицы в каждом образце. В качестве эндогенного контроля использовался ген COMT . В качестве калибратора геномная ДНК Jurkat, обработанная метилтрансферазой M.SssI. Для расчета значений RQ использовалось программное обеспечение фирмы Applied Biosystems.

На рисунках 1 и 2 приведены результы анализа метилирования для генов SHOX2, Mir-375 и TGFBR1 в образцах ткани пациентов с различ-

Таблица 1

Популяционные характеристики пациентов
	Общее кол-во образцов	Опухоль	Условная норма*
	185 (100%)	164 (100%)	21 (100%)
Возраст
До 50 лет	25 (16%)	25 (15%)	5 (24%)
После 50 лет	139 (84%)	139 (85%)	16 (76%)
Пол
Мужской	104 (64%)	104 (63%)	15 (71%)
Женский	60 (36%)	60 (37%)	6 (29%)
Гистологический тип
Аденокарцинома (АД)	-	126 (77%)	-
Плоскоклеточный рак легкого (ПРЛ)	-	24 (15%)	-
Мелкоклеточный рак легкого (МРЛ)	-	14 (8%)	-
Стадия
I	-	2 (1%)	-
II	-	159 (97%)	-
III	-	1 (1%)	-
IV	-	2 (1%)	-
Метастазы
No	-	18 (11%)	-
Nx	-	146 (89%)	-
Метастазы
Mo	-	156 (95%)	-
Mx	-	8 (5%)	-
Степень дифференцировки
Низкая	-	13 (8%)	-
Умеренная	-	30 (19%)	-
Высокая	-	4 (2%)	-
н/д	-	117 (71%)	-

* Образцы гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли.

Таблица 2

Последовательности праймеров, зондов и условия амплификации

Ген Последовательность праймеров Тотж, 0С/ Размер продукта, п.о. SHOX2 Прямой, CAAACCCCGATATTATACCG Обратный, TCGTGCGATTTCGGTCG Зонд, FAM- CGCATCCGCAAACGCCCCTCG -BHQ1 Блокатор 1: ATTATACCACACAAAAAACCA-P Блокатор 2: ATTTTGGTTGGGTAGGTG-P 60/132 Mir-375 Прямой, TCGGGATAAGTTTTAAGGC Обратный, ATCTACGACTAACACGTCG Зонд, FAM-GCGACGACCACCGCAAATACGCACCTA-BHQ1 60/160 TGFBR1 Прямой, AGTTATAAAGGGTCGGAGC Обратный, CGAAAACGCGAAACAACG Зонд, FAM-CCGCCGCCACCGCCTATAACCCGA-BHQ1 60/155 COMT Прямой, GGGATAGTGTTATTGGTTGA Обратный, CTACCTAAACCCTTATAAATAACC Зонд, FAM–TGGAATATAGGGAGGTGGTGGA–BHQ1 60/164 ными типами рака легкого.

Как можно видеть, метилирование гена SHOX2 является более частым событием при ПРЛ (79%) и МРЛ (71%) нежели АД (43%) (рис.1), что согласуется с данными других авторов [16]. Напротив, для гена Mir-375 метилирование выявляется в 8% при ПРЛ, 7% при МРЛ и 6 % при АД. Сообщалось, что Mir-375 подавляет экспрессию SHOX2 в клетках рака молочной железы [27]. Как можно видеть на рисунке

1В, из 7 образцов, в которых обнаруживается метилирование Mir-375 , четыре не обнаруживают метилирования SHOX2 . Для ПРЛ и МРЛ такие случаи отсутствуют. Это может указывать на разные механизмы при возникновении онкопатологии легких.

Рис. 1. Данные по метилированию для генов SHOX2, Mir-375 и TGFBR1 в образцах ткани пациентов с плоскоклеточным (А), мелкоклеточным нейроэндокринным (Б) и аденокацино-мой (В) легкого.

Рис. 3. Зависимость метилирования гена SHOX2 с полом пациентов.

Рис. 2. Результаты анализа метилирования для генов SHOX2, Mir-375 и TGFBR1 в образцах ткани пациентов с плоскоклеточным (ПРЛ), мелкоклеточным нейроэндокринным (МРЛ) и аденокациномой (АД) легкого.

показали, что метилирование TGFBR1 при раке легкого является довольно редким событием и обнаруживается в 7% случаев только при АД. Для ПРЛ и МРЛ отсутствие метилирования может объясняться малой выборкой образцов. С другой стороны, SHOX2 транскрипционно регулирует экспрессию TGFBR1 [17] и частое метилирование SHOX2 может приводить к снижению экспрессии TGFBR1 , что дает преимущество раковым клеткам в росте. Стоит заметить, что исследуемая выборка образцов состоит преимущественно из образцов II стадии (табл.1), это может указывать на то, что снижение экспрессии TGFBR1 является одним из ранних этапов при возникновении рака легкого. Сообщалось, что при плоскоклеточном раке пищевода метилирование гена TGFBR1 чаще отмечалось на стадии III и IV, чем на стадии I и II [28].

Для образцов условно нормальной ткани легкого метилирование генов SHOX2, TGFBR1 и miR-375 обнаружено не было (данные не приведены).

Исследованы возможные корреляции между частотами метилирования генов и клиникогистологическими характеристиками образцов пациентов. Статистически значимая корреляция с полом пациентов выявлена для гена SHOX2 (рис. 3).

Заключение

Полученные в данной результаты добавляют ясности в причины возникновения онкопатологии легких. Обнаруженная связь метилирования SHOX2 c полом пациентов требует более глубокого анализа. Кроме того, результаты данной работы могут найти применение при ранней диагностике рака легких.