Анализ микроаелеций AZF локуса Y хромосомы у мужчин c бесплодием

современном мире бесплодие представляет собой важную медико-социальную проблему, затрагивающую демографические основы общества. Бесплодием страдают около 15% супруже ских пар, при этом, неуклонно растет доля мужского фактора и по данным Европейской ассоциации урологов она в настоящее время составляет около 50% [1]. Приблизительно у 5% мужчин репродуктивного возраста имеются различные количественные и качественные изменения спермы. Около 1/3 случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому типу бесплодия, большинство случаев которого может быть обусловлено генетическими факторами, такими как различные нарушения хромосом или мутации в ответственных за сперматогенез генах [2,3].

Результаты многочисленных исследований, посвященных изучению роли генетических факторов в этиологии бесплодия, убедительно доказывают ведущее место данных факторов в структуре нарушений репродуктивной функции как у мужчин, так и у женщин [4,5]. Так, генетические факторы обуславливают, по крайней мере, 30-50% всех случаев тяжелых форм бесплодия у мужчин. Помимо аномалий кариотипа наиболее частой генетической причиной бесплодия у мужчин являются делеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF. Распространенность данной мутации среди мужчин с выраженными отклонениями в показателях спермо-граммы широко варьирует в различных популяциях и составляет в среднем 7,6% [6,7].

Делеции AZF-локуса связаны с различной степенью нарушения сперматогенеза от умеренного снижения его активности (гипосперматогенез) или блока сперматогенеза до практически полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах – Сертоли клеточный синдром (СКС) [4-6, 8-12].

Азооспермия и олигозооспер-мия тяжелой степени являются одними из наиболее тяжелых форм нарушения сперматогенеза и составляют 10-20% и 15-20%, соответственно, от всех нарушений репродуктивной функции у мужчин при измененных показателях спермо-граммы. С помощью имеющихся в настоящее время методов цитогенетической и молекулярно-генетической диагностики макро- и микро-делеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF, удается обнаружить у 10-15% мужчин с азооспермией и у 5-10% мужчин с олигозооспер-мией тяжелой степени [5-8,11-15].

Впервые роль делеций локуса Yq11 в этиологии нарушения сперматогенеза и бесплодия у мужчин была показана в 1976 г. L. Tiepolo и O. Zuffardi [16]. Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили с помощью STS-технологии (sequence-tagged sites) построить детальную карту Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала [17]. Было подтверждено наличие в дистальной части длинного плеча Y-хромосомы локуса AZF, делеции которого ответственны за нарушение сперматогенеза. В 1996 г. P.H. Vogt и соавт. на основе полученных данных о локализации и размере делеций, выявленных у 26 мужчин, предложили выделить в локусе Yq11.21-q11.23 три неперекрываю-щихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc [18].

Целью нашего исследования явилось уточнение структуры и определение роли генетических нарушений при бесплодии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

За период с 2017 по 2018 гг. было обследовано 63 пациента с первичным бесплодием. На основа- нии результатов спермиологиче-ского исследования мужчин с бесплодием разделили на 2 группы: группу с азооспермией и контрольную группу (табл. 1). В группу с азооспермией были включены 63 пациента, контрольную группу составили 30 здоровых (фертильных) мужчин.

Обследование, проведенное пациентам, включало общеклиническое, общее и специальное андроло-гическое исследование, спермато-логическое (стандартное спермио-логическое исследование, в некоторых случаях – гистологическое исследование биоптата яичка), молекулярно-генетическое исследование (анализ микроделеций Y-хромосомы).

Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ [19]. Гистологическое исследование биоптата яичка проводилось путем цитогистологического анализа [9].

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием Taq-полимераз.

Анализ микроделеций локуса AZF был проведен в соответствии с руководством по молекулярной диагностике микроделеций Y-хромосомы [12]. Для обнаружения деле-

Таблица 1. Частота делеций локуса AZF в обследованных группах мужчин

№	Группы пациентов	Количество обследованных мужчин	Число обнаруженных делеций AZF- локуса
1	Пациенты с азооспермией	63	7 (11,1%)
2	Контрольная группа	30	0 (0%)

Таблица 2. Количество обнаруженных микроделеций AZF локуса длинного плеча Y-хромосомы

Характер нарушения	n	%
Общее количество обнаруженных делеций AZF-локуса	7	100
Микроделеции AZFb-субрегиона	2	28,6
Микроделеции AZFс -субрегиона	4	57,1
Микроделеции AZFa+b+c – субрегиона	1	14,3

ций применяли мультиплексную амплификацию (МПА), предложенную в данном руководстве в собственной модификации. На первом этапе анализа выполняли детектирование делеций в трех субрегионах AZF.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди 63 обследованных мужчин кыргызов с бесплодием делеции локуса AZF были обнаружены у 7 (11,1%) пациентов (табл. 1). Деле-ции Y-хромосомы были выявлены только у пациентов с азооспермией. Ни одной Y-делеции не было обнаружено у фертильных мужчин контрольной группы. Чаще всего деле-ции располагались в AZFc-субрегионе (57,1% делеций Y-хромосомы) (табл. 2). Микроделеции субрегиона AZFb были выявлены только у двух пациентов (28,6 % случаев от всех обнаруженных делеций локуса AZF) и у одного пациента выявлена мик-роделеция AZFa+b+c – субрегиона (14,3% случаев).

Спермиологическая и гистологическая картина, обнаруженная нами у мужчин с делециями локуса AZF, выявляла различную степень нарушений сперматогенеза. У обоих пациентов с микроделециями AZFb-субрегиона отмечали азооспермию. Гистологическое исследование био-птата яичка, проведенное у одного из них, позволило выявить синдром клеток Сертоли. По результатам молекулярного анализа у этих пациентов область делеции захватывала маркер sY1197 субрегиона AZFb. У мужчин с делециями субрегиона AZFc сперматозоиды отсутствовали (азооспермия). При анализе гистопрепаратов биоптата яичка, выполненного у двух из этих пациентов, было установлено, что у одного из них половые клетки отсутствовали в большинстве семенных канальцев.

ОБСУЖДЕНИЕ

Частота обнаружения микро-делеций Y-хромосомы среди мужчин с бесплодием значительно варьирует в различных исследованиях (от 1% до 35%) [7,8,10,20]. Широкий разброс частот выявляемости деле-ций обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют критерии отбора пациентов для проведения микроде-леционного анализа. В среднем выявлено наличие делеций локуса AZF у 7,5% мужчин с бесплодием, при этом наибольшая частота делеций отмечена среди мужчин с идиопатической азооспермией (18%) или тяжелой олигозооспермией неясного генеза (14,3%) [9]. Количество деле-ций, выявленных по результатам нашего исследования, в общем аналогично частоте встречаемости де-леций отдельных субрегионов или захватывающих несколько регионов, а также аналогично средней частоте встречаемости микроделеций в азиатских популяциях [20]. При этом соотношение между различными типами выявленных нами де-леций в целом отражает структуру делеционных нарушений в локусе AZF у мужчин с бесплодием.

При делециях, захватывающих субрегионы AZFb и AZFc, у мужчин выявляются азооспермия и СКС. Определение зависимости степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации делеций может иметь прогностическое значение для возможного получения сперматозоидов, пригодных для проведения ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) – инъекцией сперматозоида в цитоплазму ооцита [5,8,11]. Наличие делеций, захватывающих субрегионы AZFa или AZFb, указывает на невозможность получения зрелых половых клеток, а у пациентов с делециями AZFc при биопсии яичка примерно в 50-70 % случаев удается получить зрелые сперматозоиды [5,11].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюме:

Введение. Одной из наиболее частых генетических причин бесплодия у мужчин являются делеции в локусе AZF, локализованном на длинном плече Y-хромосомы (Yq11), которые приводят к различной степени нарушения сперматогенеза, от сниженной его активности до синдрома клеток Сертоли, проявляясь чаще всего азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени.

Материалы и методы. При клинико-генетическом обследовании 63 мужчин кыргызов с бесплодием проведен анализ микроде-леций в локусе AZF. В 7 случаях выявлены делеции Y-хромосомы: 2 микроделеции AZFb, 4 микроделеции в субрегионе AZFc и 1 мик-роделеция в субрегионе AZFa+b+c. Обследование, проведенное пациентам, включало общеклиническое, общее и специальное андрологическое исследование, сперматологическое (стандартное спермиологическое исследование, в некоторых случаях – гистологическое исследование биоптата яичка), молекулярно-генетическое исследование (анализ микроделеций Y-хромосомы).

Результаты и обсуждение. Частота обнаружения микроде-леций Y-хромосомы среди мужчин с бесплодием значительно варьирует в различных исследованиях (от 1% до 35%). Широкий разброс частот делеций обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют критерии отбора пациентов для проведения микроделеционного анализа, в среднем выявлено наличие делеций локуса AZF у 7,5% мужчин с бесплодием, при этом наибольшая частота делеций отмечена среди мужчин с идиопатической азооспермией (18%) или тяжелой оли-гозооспермией неясного генеза (14,3%). Количество делеций, полученной в результате исследования, в общем сходна с картиной встречаемости делеций отдельных субрегионов или захватывающих несколько регионов, а также сходна по частоте микроделе-ций в среднем встречающихся в азиатских популяциях. При этом соотношение между различными типами выявленных нами делеций в целом отражает структуру делеционных нарушений в локусе AZF у мужчин с бесплодием.

Summary:Microdeletion analysis of the AZF locus of the chromosome Y in infertile males

A.Ch. Usupbaev, B.A. Rysbaev, K.N. Stambekova, R.A. Jandraliev

Introduction. One of the major genetic causes male infertility are deletions in AZF locus (Yq11) that associated with various spermatogenesis abnormalities from hypospermatogenesis to «Sertoli cells only syndrome», appearing mostly azoospermia or severe oligozoospermia.

Materials and methods. At the clinical and genetic examination of 63 infertile kyrgyz males microdeletion analysis of AZF locus was performed. Y-chromosome deletions were founded in 7 cases: two AZFb-microdeletions, four microdeletion in AZFc-subregion and one microdeletion in AZFa+b+c-subregion. The examination of patients included common clinical, general and special andrological study, a spermatological (standard spermiological study, in some cases a histological examination of the testicular biopsy), a molecular genetic study (analysis of Y chromosome microdeletions).

Conclusion. The frequency detection microdeletions Y-chromo-some among infertile men varies considerably in different studies (from 1% to 35%). A wide spread of deletion frequencies is due to the influence of a number of factors, among which the most important are the criteria for selecting patients for microdeletion analysis, on average, the presence of AZF-locus deletions in 7.5% of men with infertility was revealed, with the highest frequency of deletions among men with idiopathic azoospermia (18%) or severe oligo-zoospermia of unknown origin (14.3%). The amount of deletions obtained from the study is generally similar to the pattern of deletions occurring in individual subregions or in several exciting regions, as well as similar in the frequency of microdeletions occurring on average in Asian populations. At the same time, the ratio between different types of deletions revealed by us generally reflects the structure of deletion disorders in AZF locus in men with infertility.