Анализ полиморфизма хлоропластной ДНК культурного и дикорастущего подсолнечника Helia nthus petiolariis L

Введение. Получение гибридов с высокой продуктивностью и комплексной устойчивостью к факторам среды в первую очередь зависит от генотипов родительских линий. При этом в подавляющем большинстве основной акцент делается на комбинацию только ядер-ных аллелей. Несомненно, ядерный геном играет ключевую роль в онтогенезе растений. Однако на сегодня твердо доказаны и эффекты цитогенов, как на экспрессию количественных признаков, так и на адаптивный потенциал растений к экстремальным факторам среды (Goloenko et al., 2001; Давыденко, 1989; Машкина и др., 2010).

В настоящее время все коммерческие линии подсолнечника переводят на стерильную основу только одного типа цитоплазмы H. petiolaris (ЦМС типа РЕТ1), впервые полученной Леклерком в 1966 г. из межвидового гибрида H. petiolaris L. × H. annuus L. (Leclerq, 1969). Унификация использования в селекции одной системы ЦМС и, как следствие, одного цитоплазмона может быть причиной снижения адаптационного потенциала культурного подсолнечника. Наряду с этим демонстрируется сокращение генетической изменчивости в процессе окультуривания и дальнейшей селекции. Так Rieseberg and Seiler (1990), исследовавшие большую коллекцию диких и культурных линий подсолнечника, обнаружили, что культурные формы демонстрируют уменьшенную аллозимную изменчивость и что все они характеризуются одним единственным хпДНК RFLP гаплотипом. Таким образом, расширение или, по меньшей мере, сохранение при окультуривании спектра изменчивости генома цитоплазмы является актуальной задачей селекции подсолнечника.

В связи свышеизложенным был проведен SSR-анализа хлоропластной ДНК ЦМС- и Rf-линий культурного подсолнечника Helianthus annuus L. и дикорастущих форм Helianthus petiolaris Nutt.

Материалы и методы. Объектом исследования служил селекционный материал Донской опытной станции им. Л.А. Жданова ВНИИМК, представленный 17-ю ЦМС (ВД 1448, ЭД 931, ЭД 73, ВД 350, ВД 356. ВД 151, ЭД 1433, ЭД 236, ЭД 77, ЭД 169, ВД 255, ВД 22, ВД 149, ВД 354, ЭД 869, ВД 344, ЭД 95) и 29-ю Rf (ВД 541, ВД 110, ЭД 788, ВД 195, ВД 114, ЭД 538, ВД 62, СИ 0306, СИ 361, СИ 4917, СИ 991, СИ 90592, СИ 99017, СИ 941152, СИ 0123, СИ 2288, СИ 843, СИ 0211, СИ 40181, СИ 515, СИ 543, СИ 1671, СИ 1228, СИ 7307, СИ 1854) линиями подсолнечника, а также формами дикорастущего вида H. petiolaris с различными номерами интродукции из мировой коллекции ВИР.

Геномную ДНК выделяли из первой пары настоящих листьев проростков по методу Р. Бума (Boom et al., 1990) c нашими модификациями.

Для анализа микросателлитных последовательностей хлоропластной ДНК были отобраны SSR-маркеры (табл. 1), выявляющие, по данным литературы (Wills et al., 2005), высокий уровень полиморфизма хпДНК в семействе Compositae .

Полимеразную цепную реакцию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 67 мМ трис-HCl pH 8,4, 16 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgSO4, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 0,25 мМ каждого ДНТФ (ДАТФ, ДЦТФ, ДТТФ, ДГТФ), 15 пмоль праймера, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 30 нг выделенной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере Palm Cycler Corbett Research (Австралия) по следующей программе: первоначальная денатурация 3 мин при 95 оС, после чего десять циклов: 30 сек при 94 оС, 30 сек при 58 оC (температура отжига была уменьшена на 1 оС на каждый цикл), 45 сек при температуре 72 оС, а затем до 30 циклов: 30 сек при 94 оС, 30 сек при 48 оС, 45 сек при температуре 72 оС, а окончательная элонгация 20 мин при 72 оС.

Таблица 1

Праймеры, использованные для SSR-анализа хпДНК дикорастущего и культурного подсолнечника

Амплифицированные продукты визуализированы на автоматическом ДНК-анализаторе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems , США) с использованием программы GeneMapper ID (версия 3,2).

Результаты и обсуждение. В результате исследования 46 ЦМС-линий и Rf-линии подсолнечника по 8 хлоропластным микроса-теллитным локусам был выявлен один гаплотип (так называемый «основной» культурный гаплотип). Размер амлифицированного фрагмента у всех исследованных образцов составил: 137 п.н. для маркера ccmp 1, 126 п.н. – для ccmp 4, 95 п.н. – для ccmp 5, 192 п.н. – для NTCP 7, 257 п.н. – для NTCP 9, 185 п.н. – для NTCP 18, 157 п.н. – для NTCP 30, 254 п.н. – для NTCP 40 (рис. 1).

Рисунок 1 – Фореграммы продуктов амплификации хлоропластной ДНК культурных линий подсолнечника с SSR праймерами: 1 – ccmp 1, 2 – ccmp 4; 3 – ccmp 5, 4 – NTCP 7, 5 – NTCP 9, 6 – NTCP 18, 7 – NTCP 30, 8 – NTCP 40. По оси x – количество н.п., y – относительные флуоресцентные единицы

Отличительной особенностью хпДНК H. petiolaris от культурных линий является наличие полиморфных вариантов по исследованным SSR локусам. В результате SSR-анализа H. petiolaris было показано, что из восьми исследованных микросателлитных маркеров локусы NTCP 9 и NTCP 30 являются полиморфными (табл. 2). У пяти исследованных растений H. petiolaris для локуса NTCP 9 характерен аллель 256 п.н., для двух растений характерно наличие ампликона 255 п.н. Двумя аллельными вариантами также характеризуется локус NTCP 30 (табл. 2).

Дискриминационный потенциал изученной маркерной системы оказался недостаточным для идентификации линий культурного подсолнечника. Вследствие генетического сходства по изученным микросателлитным локусам хпДНК необходим дополнительный подбор маркеров. С другой стороны, проведенный SSR-анализ хлоропластного пластома дикорастущего вида H. petiolaris показал для маркеров NTCP 9 и NTCP 30 наличие полиморфных позиций.

Таблица 2

Аллельные различия SSR локусов хлоропластной ДНК H. petiolaris

* - в скобках указан номер интродукции H. pet-iolaris на Кубанской опытной станции ВИР им. Н.И. Вавилова

Таким образом, в данной работе была исследована изменчивость генома органелл у селекционных линий подсолнечника, а также дикорастущих форм H. petiolaris как источников потенциально важных плазмотипов. В результате анализа полиморфизма микроса-теллитных локусов хлоропластной ДНК семи генотипов H. petiolaris определены четыре гаплотипа. SSR-анализ полиморфизма хпДНК 17 ЦМС- и 29 Rf-линий (селекционный материал ДОС им. Л.А. Жданова ВНИИМК) не выявил аллельных различий. Хлоропластный геном, в данном случае, представлен одним SSR гаплотипом.

Получение селекционного материала, который наряду с высокой урожайностью и масличностью будет обладать комплексной устойчивостью к действию внешних факторов среды, возможно с привлечением потен- циала дикорастущих форм подсолнечник (Гаврилова, Анисимова, 2003). Снижение цитоплазматического генетического разнообразия, сопровождающие процессы доместикации и искусственного отбора, предполагает введение в культуру новых плазмотипов. Таким образом, обнаруженные в результате SSR-анализа хпДНК дикорастущих форм редкие плазмотипы представляют непосредственный интерес для селекции культурного подсолнечника.

Исследование выполнено при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ, госконтракты № 16.740.11.0485 и № 16.552.11.7024.