Анализ получения децеллюляризированных матриксов и их применения в сердечно-сосудистой хирургии

Однако это требует применения длительной иммуносупрессивной или антикоагуляционной терапии с целью профилактики иммунологического отторжения и тромбоэмболических осложнений. Кроме того, все современные протезы, изготовленные на основе искусственных материалов, не способны к росту и развитию в организме, что существенно ограничивает их применение в детской сердечно-сосудистой хирургии. Альтернативным методом лечения может стать применение децеллюляризированных матриксов (ДМ) тканевой инженерии, что даст возможность получить биоматериалы с комбинацией стволовых клеток и факторов роста, способных ускорить эндогенное формирование новых тканей и избежать применения тяжелой сопутствующей терапии. Наряду с этим использование ДМ позволит пренебречь созданием искусственных условий для синтеза внеклеточного матрикса [1].

Несмотря на применение в тканевой инженерии разнообразных современных технологий, таких как биопринтеры и биореакторы, до настоящего времени не удалось получить полностью функциональный трансплантат. Частично это может быть объяснено недостаточным пониманием механизмов онтогенеза, так как комбинирование биоматериалов с клетками и факторами роста не позволяет в полной степени воспроизвести сложный процесс регенерации ткани [2].

Получение и применение тканеинженерных аналогов сердца на основе ДМ при трансплантации сердца. Сердечная недостаточность (СН) характеризуется острым или хроническим нарушением работы сердца, приводящим к кислородной недостаточности и метаболическим нарушениям в тканях [3, 4].

Трансплантация сердца по-прежнему остается основным способом лечения терминальной стадии сердечной недостаточности [5, 6]. В ряде случаев подбор донорских органов для трансплантации может превышать допустимое время ожидания у реципиента, в связи с чем возрастает актуальность получения искусственного сердца с помощью биоинженерных технологий. Реализация традиционного подхода в сердечно-сосудистой тканевой инженерии во многом определяется успешностью применения синтетических или биологических матричных материалов в сочетании с клетками сердца. Обычно подобные матричные материалы, к которым относятся желатин, коллаген или синтетические полимеры in vitro, культивируют с кардиомиоцитами с целью получения полноценной сердечной ткани (при трансплантации in vivo тестируются такие параметры, как когерентные сокращения, низкое диастолическое давление и синцитиальная генерация потенциалов действия) [8, 9]. Недостаточная миграция клеток на материал-полимерной основе и возникающая воспалительная реакция вследствие его деградации являются частыми осложнениями, встречающимися in vivo, которые могут быть решены с помощью тканеинженерных технологий с использованием полуфункциональной трехмерной ткани без применения искусственных материалов-подложек [10]. Однако полученная ткань требует адекватного моделирования размеров, с доказанными сократительными и функциональными свойствами [11, 12].

Биосовместимые трёхмерные опорные структуры представляют собой компоненты внеклеточного матрикса с сохранённой геометрической формой и сосудистой архитектоникой сердца, которые могут быть получены при децеллюляризации сердца трупных доноров [13]. В доклиническом исследовании внеклеточный матрикс, полученный из малой субму-козы толстого кишечника свиньи и субмукозы мочевого пузыря, был использован в качестве сосудистого трансплантата у собаки [14]. Впервые H. C. Ott c со-авт. описали метод децеллюляризации сердца крысы с помощью коронарной перфузии [15]. Аорта крысы была каннулирована с целью поддерживания ретро- градной перфузии сердца ионными детергентами. В результате децеллюляризации удалось сохранить нижележащий внеклеточный матрикс и получить бесклеточную перфузируемую сосудистую архитектуру с функциональными бесклеточными клапанами и интактными геометрическими параметрами камер. Впоследствии полученный биологический каркас был «заселен» кардиомиоцитами и клетками эндотелия и культивировался в биореакторе в течение 28 дней с симуляцией коронарной перфузии и поддержанием электрической стимуляции. Культивируемый биологический каркас был способен генерировать сокращения. Данная методика децеллюляризации целого органа с применением перфузии растворами ионных детергентов была эффективна за счет уменьшения расстояния диффузии, необходимого для проникновения децеллюляризирующих агентов в клетки. Качество того или иного ДМ может варьировать в зависимости от возраста и патологических состояний донора.

Использование ДМ при протезировании клапанов сердца. На протяжении всей жизни клапанный аппарат сердца (трехстворчатый; легочный; митральный; аортальный клапаны) обеспечивает однонаправленный поток крови от предсердий к желудочкам и от желудочков к сердечным артериям. Ряд патологических состояний может приводить к структурным аномалиям, к деформации клапанов и к нарушению их функции с развитием острой и хронической форм сердечной недостаточности [16].

В настоящее время оптимальным видом лечения органических поражений сердечных клапанов или их структур, не поддающихся пластической коррекции, является их протезирование [17]. Наиболее часто используются искусственные протезы — механические клапаны, которые надежны и долговечны, но требуют проведения сопутствующей антикоагуляционной терапии, сопряженной с развитием тяжелых тромбоэмболических осложнений [18].

Альтернативным материалом служат биопротезы, представляющие собой аортальные клапаны свиньи и бычий перикард, закрепленные на твердой основе, например на синтетическом полимере. Биоклапаны такого типа обычно фиксируются в глутаральдегиде, который поперечно сшивает коллагеновые волокна и снижает антигенность ткани. Кроме того, антиминерализация, применяемая при изготовлении биопротезов последнего поколения, способствует уменьшению риска кальцификации [19]. Однако неизбежное разрушение ксенобиопротезов является основной причиной нарушения их функциональных свойств и повышенного риска повторных операций по сравнению с механическими протезами [20]. Методы тканевой инженерии позволят получить долговечные и неиммуногенные клапаны, которые способны к росту и ремоделированию по мере старения пациента [21, 22]. Фундаментальное требование в традиционной тканевой инженерии искусственных клапанов сердца состоит в получении трехмерного матрикса с соответствующими механическими свойствами, с подходящим типом клеток [23]. В этом случае образцами децеллюляризированных графтов могут являться гомографты аорты, а также перикард и клапаны сердца свиньи [24].

Проведены клинические исследования в области трансплантации тканеинженерных клапанов сердца. При этом получены противоречивые данные. Первое клиническое применение биологического заменителя клапана аорты (Syner Graft) — децеллюляризиро- ваный аортальный клапан свиньи (без фиксации глутаральдегидом) — описано при использовании его в операции по Россу [25]. Более поздний аналог этого протеза на основе ДМ аортального клапана свиньи протестирован во многих клинических исследованиях. Так, в 2003 г. было проведено исследование по замене сердечных клапанов у четверых детей с пороками сердца в возрасте 2,5–11 лет. В послеоперационном периоде продемонстрированы удовлетворительные функциональные качества трансплантированных клапанов. Однако в течение одного года после их трансплантации в результате разрыва клапана и раннего разрушения трое детей погибли. Кроме того, по данным гистологического исследования извлеченных сердечных клапанов было выявлено, что чужеродный коллагеновый матрикс способствовал индукции сильной воспалительной реакции. Трансплантированные графты обладали также плохой целлюляризацией и вызывали фиброз [25]. В более поздней публикации [26], в которой сравнивалась эффективность трансплантации децеллюляризиро-ваного аллографта лёгочного клапана и стандартного криоконсервированного аллографта в когорте из 63 пациентов в возрасте от 4 до 58 лет (29 из них был имплантирован децеллюляризированный аллографт лёгочного клапана, а 34 пациентам — стандартный криопресервированный аллографт), сообщается об одинаковом числе реопераций у пациентов, подвергавшихся процедуре Росса, в то время как количество отторжений было не в пользу Syner Graft [26].

Другой биологический заменитель лёгочного клапана — Matrix P был тестирован в реконструкции выносящего клапана правого желудочка при наследственных либо приобретенных заболеваниях сердца или с целью замены лёгочного клапана при операции Росса [27]. В частности, в 2012 г. опубликованы данные о результатах хирургических реконструкций выносящего клапана правого желудочка у 93 пациентов (медиана возраста 0,16–290 месяцев) с использованием децеллюляризированных лёгочных биоклапанов свиньи, Matrix P и Matrix P Plus. У 35,5% пациентов зарегистрировано разрушение ксенографтов, а у 29% — дисфункция клапанного аппарата. Разрушение графтов произошло в результате их расширения или стеноза. Во всех удаленных образцах при гистологическом исследовании были выявлены выраженный воспалительный процесс и слабая цел-люляризация [27]. Однако в другом исследовании по применению биоклапанов Matrix P, в котором проводилась реконструкция клапанного аппарата по поводу различных врожденных пороков сердца 61 пациенту в возрасте от 9 дней до 50 лет, были продемонстрированы удовлетворительные функциональные свойства этих клапанов [28].

Получение аллографтов сосудов и тканеинженерных конструкций на их основе. В настоящее время реконструктивная сердечно-сосудистая хирургия активно развивается. Наиболее часто при патологиях коронарных и периферических сосудов применяются шунтирующие операции [29]. В качестве шунтов преимущественно используются аутологичные сосуды (подкожные вены или внутренняя артерия молочной железы). Однако у 40% пациентов, которым необходимо проведение операций артериального шунтирования, собственные сосуды подходящего качества, диаметра и длины могут отсутствовать. Но даже если удается получить необходимый аутологичный графт, существуют риски развития окклюзии сформированного шунта в связи с наличием атеросклеротических изменений в нативных нешун-тированных артериях [30, 31]. Это способствовало поиску других источников получения сосудистых протезов.

Наиболее часто в сосудистой хирургии при шунтировании сосудов крупного диаметра в качестве протезов используются графты, сделанные из синтетических полимеров, которые показали отличные результаты. Однако они практически не используются в аортокоронарном шунтировании вследствие повышенного риска развития тромба на поверхности просвета сосудов малого диаметра [32]. Синтетические сосудистые графты демонстрируют также недостаточные механические свойства по сравнению с аутологичными, что может привести к окклюзии графта [33].

С использованием подходов тканевой инженерии удалось получить сосудистые графты, обладающие соответствующими структурными и механическими свойствами, например набуханием и растяжением, а также удержанием шва и проводимостью клеток [34]. Сообщалось также, что имплантированные бесклеточные аллографты артерий не вызывают иммунологического отторжения [35, 36].

По данным литературы, для изготовления ДМ сосудов наиболее часто используется метод двусторонней перфузии с растворами детергентов. В первых публикациях в качестве децеллюляризующего вещества использовался додецилсульфат натрия (SDS), который приводил к образованию внеклеточного матрикса с морфологически интактными эластиновой и коллагеновой сетями, что способствовало снижению иммуногенности аллографта или ксенографта. При этом полученные ДМ обеспечивали оптимальное микроокружение для поддерживания миграции клеток, их роста и дифференцировки, но не обладали необходимыми сосудам физико-механическими свойствами [37, 38].

Таким образом, дальнейшая задача, которая стояла перед специалистами тканевой инженерии, заключалась в разработке методик децеллюляри-зации с получением сосудистых графтов, обладающих механическими свойствами нативных сосудов и не вызывающих иммунологического отторжения. В исследовании J. C. Fitzpatrick (2010) были продемонстрированы различные протоколы с использованием в качестве децеллюляризующего вещества SDS, Triton X-100/деоксихолата натрия и Triton X-100/ EDTA (динатриевая соль этилендиаминтетрауксус-ной кислоты). Это позволило полностью лизировать гладкие миоциты сосудов, что привело к значительно меньшей вариабельности механических параметров. При этом раствор Triton X-100/деоксихолата способствовал более эффективному удалению клеток [39]. Однако в исследовании Y. Zou с соавт. (2012) преимущества в использовании Triton X-100 по сравнению с додецилсульфатом натрия выявлено не было: оба вещества способствовали эффективному удалению клеток из свиной аорты и сохранению нативной структуры внеклеточного матрикса [40]. Эффективность додецилсульфата натрия также была доказана в работах N. D. Martin с соавт. (2005) при децеллю-ляризации подкожных вен человека. Полученные ДМ характеризовались сохраненной морфологией коллагеновой сети [41].

В дальнейшем, ввиду простоты получения ДМ и их широкой доступности, было разработано множество методологических подходов для получения тканеинженерных кровеносных сосудов (ТИКС), большинство из которых основаны на сочетании бесклеточных матриц с аутологичными типами клеток. Однако в некоторых публикациях описываются альтернативные технологии — получение тканеинженерных сосудов, созданных из листов клеток без использования матрицы-подложки [42].

При конструировании ТИКС получены противоречивые результаты. Так, M. Hoenicka с соавт. (2008) исследовали возможность применения пупочных вен человека в качестве источника ТИКС. Они показали, что пупочные вены, эндотелий которых был предварительно удален, могут быть совместно культивированы с аутологичными клетками, полученными от пациентов, которым назначили аортокоронарное шунтирование, с целью образования неоэндотелия и достижения им 80% конфлюентности [43]. Также авторами была поставлена задача изучить целесообразность использования децеллюляризирован-ной пупочной вены человека в качестве матрицы для аллографтов при шунтировании. Сосуды были децеллюляризированы различными детергентами, осмотическим лизисом и пероксиуксусной кислотой. В итоге авторами было показано, что децеллюляри-зированные пупочные вены, по-видимому, требуют дополнительных модификаций, чтобы поддерживать оптимальный сидинг аутологичных клеток. В связи с этим удаление эндотелия сосудов донора и замещение эндотелием реципиента представляется более перспективной альтернативой немодифицирован-ным децеллюляризированным матриксам пупочных вен при конструировании ТИКС с неиммуногенными люминальными поверхностями [43].

N. L’Heureux с соавт. (1993) удалось получить ТИКС с помощью альтернативной технологии. Образованный графт был представлен исключительно культивируемыми миоцитами и фибробластами человека. После тридцати дней культивирования происходило формирование листков, которые закручивались вокруг инертной трубчатой основы.

Образованный в результате цилиндрический конструкт помещался в биореактор, который обеспечивал люминальный поток культуральной среды и механическую поддержку. После недели культивирования на реконструированную среднюю оболочку сосуда «накручивался» листок фибробластов, образующий адвентицию. После восьми недель культивирования в биореакторе внутренняя трубчатая мандрель была удалена и в оба конца полученного конструкта введены канюли для обеспечения посадки клеток эндотелия в просвет. Полученная модель была трансплантирована собакам при окклюзии бедренной артерии. С целью предотвращения развития немедленного тромбоза, связанного с острой реакцией отторжения эндотелия ксенографта, эндотелий данных сосудистых конструктов был удален. В 50% авторами была зарегистрирована проходимость сосудистых аллотрансплантантов [42].

В исследовании М. Bertanha c соавт. удалось получить тканеинженерный кровеносный сосуд, эндотелий которого был реконструирован за счёт сокуль-тивирования децеллюляризованных SDS матриксов полых вен кроликов с мультипотентными стромальными клетками (МСК), дифференцировка которых в эндотелиоциты индуцировалась фактором роста эндотелия (EIGF), полученного из лизатов тромбоцитов человека [44]. После трёх недель сокультиви-рования с МСК используемые матрицы подвергались иммуногистохимическому анализу с использованием моноклональных антител против фасцина — белка, широко экспрессирующегося в клетках эндотелия. Кроме того, морфология децеллюляризированных матриксов оценивалась методом окрашивания трихром по Массону с целью подтверждения полного удаления клеток. Результаты гистологических исследований, приведенных в работе, показали присутствие в просвете децеллюляризированных матриксов эпителиально-подобных клеток с уплощенной / вытянутой морфологией, в дальнейшем идентифицированных как эндотелиальные [44]. Таким образом, был разработан метод реконструирования функционально активного эндотелия в просвете децеллюляризи-рованного матрикса полой вены с использованием стволовых клеток; в совокупности сочетание биоматрикса, МСК и индукции их дифференцировки в эн-дотелиоциты представляется интересным подходом для получения ТИКС [44].

Другой подход к получению ТИКС был применен Z. H. Syedain с соавт. (2014), где графты с диаметром 4 мм и длиной до 2–3 см были изготовлены из фибринового геля, реконструированного in vitro кожными фибробластами овец. Фибрин в форме гидрогеля использован в качестве основного поддерживающего материала, что позволяло нивелировать риски развития иммунологической реакции хозяина на остаточный синтетический материал [45]. Культуру фибробластов кожи овцы вводили в трубчатую основу длиной до 9 см, с внешним и внутренним диаметром 12,5 мм и 4 мм соответственно, содержащую стеклянную мандрель. Полученные графты культивировали в проточном биореакторе непрерывного действия в течение трех недель [45]. Далее они были де-целлюляризированы смесью детергентов SDS+Triton X-100 с последующей инкубацией с ДНКазой. Полученные ТИКС были использованы при трансплантации шести овцам в качестве графтов бедренных артерий на срок от 8 до 24 недель. После вывода животных из эксперимента проводили гистологическое исследование имплантированных биопротезов. Гистологический анализ эксплантированных графтов показал наличие миграции как на люменальной, так и на аблюминальной поверхности. Частичная эндо-телиализация графтов в их средних участках была заметна после восьми недель, в то время как анастомозы были полностью покрыты эндотелием. После 24 недель восстановление эндотелия наблюдалось по всей длине графта. Таким образом, было показано, что полученные на основе суспензии фибробластов дермы овцы c фибрином ТИКС могут быть потенциально применены в качестве имплантатов при окклюзии бедренных артерий и не являются тромбогенными [45].

Клинические примеры использования ТИКС в сердечно-сосудистой хирургии. Тканеинженерный сосудистый имплантат был получен из аутологичных васкулярных клеток, вырощенных в культуре и заселённых на биодеградируемый каркас из поли-капролактон-полилактида [46]. Получившийся аутологичный искусственный сосуд был имплантирован на место сонной артерии когорте из 42 пациентов в возрасте от 1 до 24 лет (медиана возраста составляла 5,5 года). Авторами не было зарегистрировано тромботических осложнений или стенозов тканеинженерных аллографтов; все графты обладали хорошей проводимостью, и, кроме того, их диаметр увеличивался со временем (110%+/-7% относительно размера имплантата) [46].

Несколькими годами позднее другим коллективом авторов сделано сообщение о клиническом приме- нении ТИКС для реконструкции подвздошной вены 49-летней пациентки [47]. Реконструкция подвздошной вены была выполнена с помощью тканеинженерной неовены, полученной при заселении криопресер-вированного децеллюляризированного аллографта эндотелиальными клетками подкожной вены реципиента и культивирования данной конструкции в биореакторе. В первые три месяца после трансплантации регистрировалось открытое состояние ТИКС, однако в результате злокачественной опухоли малого таза, наблюдаемой у пациентки, в течение четвертого месяца наблюдалась обструкция графта [47].

Другая группа исследователей применяла многослойные клеточные слои для создания сосудов, которые были использованы при проведении гемодиализа [48]. В этом исследовании десяти пациентам с терминальной почечной недостаточностью, подвергавшимся гемодиализу, были имплантированы полностью аутологичные ТИКС, полученные с использованием технологии, описанной N. L’Heureux с соавт. Графт был функциональным в течение 6–20 месяцев после имплантации [48].

Как уже отмечалось, заболевания сердечно-сосудистой системы являются основной причиной смертности во всем мире. По оценкам экспертов ВОЗ, в 2012 г. от сердечно-сосудистых заболеваний умерло 17,5 млн человек, что составило 31% всех случаев смерти. Часто единственным способом лечения данных заболеваний является трансплантация целого органа, как при терминальной стадии сердечно-сосудистой недостаточности, так и его части, сосудов или сердечных клапанов. Важно подчеркнуть, что трансплантация децеллюляризированных аллографтов сердечных клапанов, в особенности в том случае, когда они не заселяются аутогенными эндотелиальными клетками-предшественницами, приводит к неудовлетворительным результатам. По сравнению с децеллюляризированными аллографтами клапанов, децеллюляризированные матриксы и полученные на их основе ТИКС используются куда более широко в восстановительной хирургии, при этом наихудшие результаты (неудовлетворительная проходимость, тромботические и инфекционные осложнения) демонстрируют аллогенные сосудистые аллотрансплантаты, полученные на основе PТFE (политетрафторэтилен) — матриксов; значительно лучшими альтернативами являются криопресервированные сосудистые аллографты маргинального происхождения и ТИКС, полученные в результате заселения децеллюляризированного матрикса (синтетического или полученного от сосудов маргинальных доноров) аутологичными МСК рецепиента.

Именно поэтому получение и изучение кардиоваскулярных протезов на основе децеллюляризирован-ных матриксов с комбинацией аутологичных клеток и факторов роста — актуальная задача, которая стоит перед современными исследователями в данной области.

Обобщая, можно заключить, что взаимодействие между различными областями тканевой инженерии, включающее в себя (но не ограниченное ими) стволовые клетки, биоматериалы, технологии децеллю-ляризации / рецеллюляризации и криоконсервации, будет являться ключевым фактором для успешного применения децеллюляризированных матриксов в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.