Анализ сцепления гена устойчивости к расе G заразихи с микросателлитными локусами у линии-донора подсолнечника селекции ВНИИМК RGP1

Введение. Одним из главных биотических факторов, лимитирующих получение высоких урожаев подсолнечника, является паразитическое растение заразиха ( Orobanche cumana Wallr.). При отсутствии резистентности у возделываемых гибридов ущерб урожаю, наносимый данным паразитом, может составить до 100 % [1]. На данный момент сообщается об обнаружении, по крайней мере, восьми рас, обозначенных буквами от А до Н в порядке возрастания вирулентности [2].

Наиболее эффективным и экологически безопасным методом борьбы с заразихой считается возделывание устойчивых сортов и гибридов подсолнечника. Создание резистентных генотипов включает в себя поиск и использование источников устойчивости в селекционном процессе, а также обеспечение точных и производительных процедур оценки материала. Учитывая, что устойчивость подсолнечника быстро преодолевается с появлением более вирулентных рас паразита, необходимо непрерывно вести процесс внедрения и комбинирования генов устойчивости [3; 4].

Устойчивость подсолнечника к расам заразихи контролируется различными способами: одним доминантным [5], од-4

ним или двумя рецессивными и двумя частично доминантными аллелями генов [4; 6]. Это говорит о наличии различных источников устойчивости, обусловленных происхождением генетического материала. Тем самым для обеспечения оценки селекционного материала с помощью ДНК-маркеров (маркер-ассо-циированной селекции) необходимо картировать ген устойчивости для каждого источника. Пять локусов количественных признаков (QTL), обеспечивающих устойчивость к расе E, и шесть QTL – к расе F, были обнаружены в семи разных хромосомах [5]. Расоспецифичный ген, контролирующий устойчивость к расе E – Or 5 картирован в теломерной области хромосомы 3, находится на 7,5 сМ выше маркера ORS1036 [7]. В той же хромосоме был обнаружен ген устойчивости к расе выше F, который предварительно обозначен как or ab-vl-8 и локализован на 1,5 сМ ниже маркера ORS683 и 19,6 сМ ниже маркера ORS1036 [4]. Несмотря на близкое расположение к гену Or 5 , доказано, что эти гены различны. Позже, I. Ime-rovski et al. [8] картировали от 2 до 23 значимых QTL в геноме подсолнечника. Два основных QTL располагались в хромосоме 3. Так же один ген устойчивости к расе F O. cumana был описан и картирован в хромосоме 7 [9].

Во ВНИИМК были созданы линии подсолнечника, устойчивые к расе G заразихи. Установлено, что устойчивость у этих линий контролируется одним геном Or 7 с неполным доминированием [10]. Эти линии представляют ценный источник для переноса генов с использованием ДНК-маркеров (МАС). Использование данных генов в селекции позволит создавать безопасные и качественные продукты питания с использованием современных генетических методов. В связи с этим целью исследования является анализ сцепления гена Or 7 с микросателлитными локусами у линии-донора устойчивости к расе G заразихи RGP1 коллекции ВНИИМК.

Материалы и методы. Материал исследования – линия-донор устойчивости к расе G заразихи RGP1 и восприимчивая к этой расе линия ВК678 селекции ВНИИМК. Растения подсолнечника были скрещены в полевых условиях для получения гетерозиготного поколения F 1. Затем проведено самоопыление растений F 1 с получением потомства F 2. Растения тестировали в теплице на устойчивость и восприимчивость на инфекционном фоне из семян заразихи расы G, применяя метод ранней диагностики [10].

ДНК подсолнечника экстрагировали из верхушечных листьев молодых побегов вегетирующих растений. Выделение ДНК производилось по методу Vroh et аl. с добавлением активированного угля [11]. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5–3 мM MgCl 2 ; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Си-бэнзим, Россия). Для амплификации использовали термоциклер S1000^тм (BioRad, США). Для увеличения специфичности гибридизации праймеров с матрицей ДНК использовали ступенчатую ПЦР (touchdown PCR). Условия амплификации: начальная денатурация 95 °C в течение 2 мин, 1 цикл при соблюдении температурно-временного режима: 94 °C – 30 сек, 64 °C – 30 сек, 65 °C – 45 сек, затем шесть циклов с уменьшением температуры отжига на 1 °C на цикл, следом 32 цикла при соблюдении температурновременного режима: 94 °C – 30 сек, 58 °C – 30 сек и 65 °C – 45 сек. Финальная элонгация 65 °C – 20 мин. Для ПЦР анализа использовали три SSR-праймера, показавшие полиморфизм у родительских линий в предыдущем исследовании: ORS 683, ORS 1040, ORS 1112 [12].

Электрофорез продуктов амплификации проводили в полиакриламидном геле

(8 %, 1хТБЕ) с использованием камеры VE-20 для вертикального электрофореза (Хеликон, Россия) в течение 2,5–3 часов при силе тока 40–50 mA и напряжении 200–230 V. Результаты электрофореза документировали при помощи гель-доку-ментирующей видеосистемы BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). Размер фрагментов ДНК определяли с использованием программного обеспечения BioCapture (Vilber Lourmat, Франция) относительно маркера длины фрагментов ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Сибэнзим, Россия). Математическую обработку результатов расщепления проводили с использованием χ²-критерия соответствия фактических расщеплений теоретически ожидаемым в моно- и дигибридных скрещиваниях. Расчет частоты рекомбинации r и ошибку рекомбинации s p по результатам расщепления в F 2 рассчитывали по методу максимального правдоподобия [13].

Результаты и обсуждение. Для установления локализации гена, контролирующего устойчивость к расе G заразихи, I. Imerovski et al. была составлена частичная SSR карта LG3 подсолнечника, содержащая ген or ab-vl-8 . Согласно карте, данный ген локализуется в верхней части хромосомы [4]. С использованием BSA-seq I. Imerovski et al . также были обнаружены предполагаемые гены-кандидаты устойчивости – HanXRQChr03g0076321 и HanXRQChr03g0065841 [8]. Основываясь на полученных этими авторами результатах, мы проводили подбор генетических маркеров к гену Or 7 [12]. В рамках настоящего исследования используемые в работе SSR-локусы были сопоставлены со сборкой репрезентативного генома подсолнечника HanXRQr2.0-SUNRISE. По этим данным с помощью инструмента Basic Local Alignment Search Tool (BLAST^®) составлена физическая карта положения локусов в LG3 (рисунок).

Таблица 1

Аллельные состояния SSR-локусов ДНК подсолнечника у гибрида F 1 (ВК678 × RGP1) и его родительских линий, восприимчивой и устойчивой к расе G заразихи

Генотип Ген SSR-локусы ORS 683 ORS 1112 ORS 1040 ВК678 or7or7 364* 347 192 RGP1 Or7Or7 400 375 200 F1 (ВК678× RGP1) Or7or7 364/400 347/375 192 число пар нуклеотидов фрагмента ДНК

Рисунок – Положение SSR-локусов, предположительно сцепленных с геном Or 7 , и генов-кандидатов в LG3 H. annuus

Согласно этой карте, в верхней части LG3 располагается группа локусов (ORS 683, ORS 1112, ORS 1040, ORS 665, ORS 202, ORS 1036), находящихся выше предполагаемого нахождения гена устойчивости к расе G заразихи (рисунок).

Для Or 7 у были RGP1,

установления локализации гена линий селекции ВНИИМК нами выбраны линии подсолнечника устойчивая к расе G заразихи, и

ВК 678, восприимчивая к этой расе. У этих линий обнаружено три маркерных микросателлитных локуса с контрастными аллельными вариантами [12]. Это локусы ORS 1040, ORS 1112, ORS 683. Полученные после скрещивания родительских линий семена подсолнечника F 1 (ВК678 × RGP1) были проверены на гиб-ридность по ДНК локусам. По результатам анализа было установлено, что два локуса – ORS 683, ORS 1112 – имели кодоминантное наследование аллелей. По этим локусам у гибрида выявили две родительские фракции ДНК. Представляет интерес тот факт, что I. Imerovski et al. [4] определили эти локусы, как локусы с доминантным наследованием аллелей. У локуса ORS 1040 выявлена одна фракция, следовательно, имеет место доминирование одного аллеля над другим (табл. 1).

После получения потомства F 2 анализ расщепления по устойчивости подсолнечника к расе G заразихи для данной комбинации скрещивания показал, что фактически наблюдаемое расщепление соответствовало теоретически ожидаемой модели 3 : 1 при моногенном наследовании признака (табл. 2).

Таблица 2

Наследование признака устойчивости подсолнечника к расе G заразихи в F 2 при скрещивании линий ВК678 и RGP1

Ген	Всего растений, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ2	df	Р
Or 7	107	3 : 1	0,24	1	0,7–0,8

Ранее было установлено, что у линии подсолнечника RGP1 устойчивость обеспечивается действием одного гена Or 7 с доминантным типом наследования [10]. Наши исследования также подтвердили этот тип наследования у данного генотипа.

Также был проведен гибридологический анализ результатов расщепления в F 2 для трех ДНК-локусов. Локусы ORS 683 и ORS 1112 являются кодоминантными, и во втором поколении расщепление соответствует модели 1 : 2 : 1, а у доминантного локуса ORS 1040 – модели 3 : 1 (табл. 3).

Таблица 3

Наследование SSR-локусов ДНК ORS 683, ORS 1040 и ORS 1112 при скрещивании линий ВК678 и RGP1

Локус	Всего растений, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ2	df	Р
ORS 683	98	1:2:1	1,16	2	0,56
ORS 1112	94	1:2:1	2,37	2	0,67
ORS 1040	102	3:1	3,84	1	0,05

Для данных локусов χ²-критерий достоверно подтверждал соответствие фактических расщеплений теоретически ожидаемым. Следовательно, комбинация скрещивания пригодна для дальнейшего анализа. Проведен тест на совместное наследование гена Or 7 c этими локусами, а также SSR-локусов друг с другом (табл. 4).

Таблица 4

Значения χ² между геном Or 7 и SSR-локусами ДНК в потомстве F 2 (ВК 678 × RGP1)

Расщепляющиеся локусы	Всего растений, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ2	df	Р
Or 7 –ORS 683	98	3:6:3:1:2:1	4,96	5	0,08
Or 7 – ORS 1112	89	3:6:3:1:2:1	7,42	5	0,19
Or 7 – ORS 1040	102	9:3:3:1	7,27	3	0,06
ORS 683 – ORS 1112	94	1:2:1:2:4:2:1:2:1	19,2	8	< 0,05
ORS 1040 – ORS 683	97	3:6:3:1:2:1	8,33	5	0,15
ORS 1040 – ORS 1112	88	3:6:3:1:2:1	2,06	5	0,30

В таблице 4 представлены данные по оценке совместного наследования гена Or 7 c ДНК локусами, где отмечено значение χ², которое характеризует отклонение от независимого расщепления приведенных локусов. Показаны также вероятность нулевой гипотезы о независимом наследовании (P) между анализируемыми генами. Тест на совместное наследование показал независимое наследование гена Or 7 c локусами ДНК ORS 683, ORS 1040, ORS 1112, а также SSR-локусов ORS 1040 с ORS 1112 и ORS 1040 с ORS 683. Независимое наследование пары локусов ORS683 – ORS 1112 не подтвердилось (χ2 = 19,2; Р <0,05) (табл. 4).

Была выполнена оценка частоты рекомбинации между парами локусов Or 7 – ORS 683, ORS 1040 – ORS 1112, ORS 683 – ORS 1112 (табл. 5).

Таблица 5

Значения частот рекомбинации между геном Or 7 и SSR-локусами ДНК в потомстве F 2 (ВК678 х RGP1)

Расщепляющиеся локусы	r	s p
Or 7 – ORS 683	0,39	0,06
ORS 683 – ORS 1112	0,27	0,41
ORS 1040 – ORS 1112	0,56	0,60

Тест подтвердил сцепление локусов ORS 683 – ORS 1112 с частотой рекомбинации 0,27 ± 0,41 (27 сМ). Частота рекомбинации локусов Or 7 – ORS 683 составила 0,39 ± 0,06 (39 сМ). Вероятно, сцепление между генами отсутствует или очень слабое. Коэффициент рекомбинации между локусами ORS 1040 – ORS 1112 составил более 50 %, что говорит об отсутствии сцепления между этими локусами. Мы предполагаем следующий порядок расположения генов в данном сегменте хромосомы подсолнечника LG3: Or 7 – ORS 683 – ORS 1112 – ORS 1040 с расстояниями между ними 39, 27 и 56 сМ соответственно. Такой порядок расположения локусов согласуется с их расположением на SSR [4] и физической карте, сконструированной нами. Однако полученные данные частот рекомбинации между исследуемыми генами не совпадают с результатами исследований других авторов. Так, согласно I. Imerovski et al. [4], SSR-локус ORS 683 находится на расстоянии 1,5 сМ выше гена or ab-vl-8 . У этих же авторов дистанция между ORS 683 и ORS 1112 составляет 9,8 сМ. Tang et al. [7] определили дистанцию между ORS 683 и ORS 1112 в 0,9 сМ, а между ORS 683 и ORS 1040 – 7 сМ. Этими авторами было отмечено, что на оценку расстояния между локусами могут оказать влияние фенотипические ошибки, потому что идентификация восприимчивого фенотипа как устойчивого при классификации приводит к увеличению класса рекомбинантных генотипов и искажает дистанции на генетической карте [7]. Кроме того, оценка частоты рекомбинации зависит от генотипов, которые используются для анализа [14].

Вероятно, ген, который контролирует устойчивость к расе G заразихи у линии RGP1, не является идентичным гену orab-vl-8, описанному сербскими учеными. Исходя из литературных данных, мы предполагаем, что он локализуется в этой же хромосоме ниже области, в которой производился поиск. Предложенные гены-кандидаты располагаются также в области ниже маркера ORS 683 [8]. В связи с этим будет продолжена работа по поиску местонахождения гена Or7 и локусов ДНК, сцепленных с ним, в нижних областях LG3.

Выводы. В результате проведенных исследований было исключено расположение гена Or 7 в области непосредственной близости к микросателлитным локусам ORS 683, ORS 1040, ORS 1112. Локусы ORS 683 – ORS 1112 показали сцепление с частотой рекомбинации 0,27 ± 0,41 (27 сМ). На основании изученных литературных источников и репрезентативного генома подсолнечника HanXRQr2.0-SUNRISE составлена частичная физическая карта LG3 для определения области дальнейшего поиска локализации гена Or 7 и ДНК-маркеров, косегрегирующих с ним.